3-メチルアデニンDNAグリコシラーゼの反応機構

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大腸菌の3-メチルアデニンDNAグリコシラーゼII(AlKA)は、強力な突然変異、致死作用を有するアルキル化剤によるDNA損傷の主生成物の一つ、3-メチルアデニンを除去し、生命の維持に働くDNA修復酵素である。申請者は本酵素のX線構造解析を行ない、2.3A分解能の3次元構造を得、活性部位を推定、変異酵素を用いた活性実験から活性残基を示した。本研究の最終目的は、本酵素とアルキル化DNA基質アナログ複合体のX線構造解析を行ない、アルキル化DNA基質認識機構を解明すること、並びに、ラウエ法を用いてグリコシラーゼ反応機構を解明することである。本年度は以下の研究成果を得た。(1)AlKAの3次元構造からアルキル化DNAとの複合体結晶作成にふさわしい鎖長をコンピューターグラフィックスで検討した。基質であるアルキル化DNAオリゴマーは化学合成が不可能なので、幾つかの合成可能な基質アナログを含む適当な鎖長のDNAオリゴマーを用いてAlKAとの相互作用を調べているが、現在のところ複合体結晶化に有効な修飾DNAオリゴマーを得られていない。引き続きAlKAと相互作用の強い修飾DNAオリゴマーの検索を行なう。(2)AlKAと活性が減少した変異蛋白質について、ラウエ法で酵素反応機構を解明する上で基礎となる酵素反応の速度論的解析を行なった。明らかになったKcatの値からAlKAの反応は、数分のオーダであること、変異型の反応はさらに遅いことがわかり、ラウエ法に加え、LTO(Large-angle Oscillation Technique)も利用できることが示唆された。(3)また、同様に求めたKm値からTrp218がアルキル化DNA基質認識に関与していることが示唆された。