DNA複製・細胞周期チェックポイントを制御する複合体の統合的立体構造解析

控制 DNA 复制和细胞周期检查点的复合物的集成三维结构分析

• 批准号: 13033028
• 负责人: 野島 博
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13033028/
• 关键词: Mcm蛋白質; DNA複製; 電子顕微鏡; 画像を解析; ドーナツ型構造; プルダウンアッセイ; ツーハイブリッドアッセイ; DNAヘリカーゼ活性; ヒトMcm蛋白質; Pull down assay; Two-hybrid assay; ヘテロ4量体; ヘテロ6量体

我々は電子顕微鏡観察により、6種類のヒトMcm蛋白質(HsMcm2,-3,-4,-5,-6,-7)のうちDNAヘリカーゼ活性を有するMcm4-6-7複合体(ヘテロ6量体)およびその活性が阻害されたMcm2-4-6-7複合体(ヘテロ4量体)の構造を解析した。その結果、まずヒトMcm4-6-7複合体は外径が13-14nm、内径が3-4nmのドーナツ型の構造をとることを見出した。次に、ヒトMcm2-4-6-7複合体については1462個の画像を解析した結果、509,441,278,234という4種類のグループに分かれた。そのうち509,441個の画像はよく似た4つの角を持つ外径が15-18nm、内径が3-4nmのドーナツ型の構造をとっていた。これら4つの角は各HsMcm2,-4,-6,-7蛋白質に由来する画像では無いかと予測される。とくに509個の画像は角のひとつから腕のようなものが伸びているため、この画像がサイズの最大なHsMcm2に由来するのではないかと予想した。この他、大腸菌で発現させ精製したGST-Mcm4,-Mcm6,-Mcm7用いてプルダウンアッセイを行いMcm4とMcm6、Mcm4とMcm7およびMcm6とMcm6の高い相互作用を見出した。また、ツーハイブリッドアッセイも行い、Mcm2とMcm6およびMcm6とMcm6の相互作用を確認した。これは、Mcm6がホモ2量体を形成することを示唆する。これらの結果を総合して、Mcm2-4-6-7ヘテロ4量体ではMcm2,Mcm6,Mcm4,Mcm7の順番で、Mcm4-6-7はヘテロ6量体ではMcm7-Mcm4-Mcm6-Mcm6-Mcm4-Mcm7の順序でドーナツ型の構造をとっていると結論した。

I 々 は electronic 顕 micromirror 観 examine に よ り, 6 species の ヒ ト Mcm protein (HsMcm2, 3, 4, 5, 6, 7) の う ち DNA ヘ リ カ ー ゼ activity を す る Mcm4-6-7 complex (ヘ テ ロ 6 quantity body) お よ び そ の active が resistance against さ れ た Mcm2-4-6-7 complex (ヘ テ ロ 4 quantity body) の Construct を parse た. そ の results, ま ず ヒ ト Mcm4-6-7 complex が 13-14 nm は diameter, diameter が 3-4 nm の ド ー ナ ツ type の tectonic を と る こ と を shows し た. に, ヒ ト Mcm2-4-6-7 complex に つ い て は 1462 portraits の を parsing し た results, 509441278234 と い う 4 kinds の グ ル ー プ に points か れ た. そ の う ち 509441 portraits の は よ く like た 4 つ の Angle を hold 15-18 nm が つ diameter, inner diameter が 3-4 nm の ド ー ナ ツ type の tectonic を と っ て い た. The に origin する image of the -4,-6,-7 proteins of each HSMCM ² in the <s:1> れら4 <s:1> Angle <e:1> で で no <s:1> と と was measured される. 509 portraits の と く に は Angle の ひ と つ か ら wrist の よ う な も の が stretch び て い る た め, こ の portrait が サ イ ズ の biggest な HsMcm2 に origin す る の で は な い か と to think し た. こ の him, coliform で 発 now さ せ refined し た GST - Mcm4, - Mcm6 - Mcm7 use い て プ ル ダ ウ ン ア ッ セ イ を line い Mcm4 と Mcm6, Mcm4 と Mcm7 お よ び Mcm6 と Mcm6 の high い を show the interaction between し た. ま た, ツ ー ハ イ ブ リ ッ ド ア ッ セ イ も い, Mcm2 と Mcm6 お よ び Mcm6 と Mcm6 の interaction を confirm し た. The を れ and Mcm6がホモ2 volumes を form する とを とを indicating する. こ れ ら の results を 総 close し て, Mcm2-4-6-7 ヘ テ ロ 4 quantity body で は Mcm2, Mcm6, Mcm4, Mcm7 の shun's で, Mcm4-6-7 は ヘ テ ロ 6 quantity body で は Mcm7 Mcm4 - Mcm6 - Mcm6 - Mcm4 - Mcm7 の order で ド ー ナ ツ type の tectonic を と っ て い る と knot On た.

项目成果

Shimada, M., Nabeshima, K., Tougan, T., Nojima, H.: "The meiotic recombination checkpoint is regulated by checkpoint rad+ genes in fission yeast"EMBO Journal. 21・11. 2807-2818 (2002)

Shimada, M.、Nabeshima, K.、Tougan, T.、Nojima, H.：“裂殖酵母中的减数分裂重组检查点由检查点 rad+ 基因调节”EMBO 杂志 21・11（2002）。

Watanabe, T., Miyashita, K., Saito, T.T., Yoneki, T., Kakihara, Y., Nabeshima, K., Kishi, Y.A., Shimoda, C., Nojima, H.: "Comprehensive isolation of meiosis specific genes identifies many unusual non-coding transcripts in Schizosaccharomyces pombe"Nucleic

Watanabe, T.、Miyashita, K.、Saito, T.T.、Yoneki, T.、Kakihara, Y.、Nabeshima, K.、Kishi, Y.A.、Shimoda, C.、Nojima, H.：“减数分裂特异性基因的全面分离

Molnar, M., Parisi, S., Kakihara, Y., Nojima, H., Yamamoto, A., Hiraoka, Y., Bozsik, A., Sipiczki, M., Kohli, J.: "Characterization of rec7, an early meiotic recombination gene in Schizosaccharomyces pombe"Genetics. 177・2. 519-532 (2001)

Molnar, M.、Parisi, S.、Kakihara, Y.、Nojima, H.、Yamamoto, A.、Hiraoka, Y.、Bozsik, A.、Sipiczki, M.、Kohli, J.：“rec7 的表征，粟酒裂殖酵母的减数分裂早期重组基因《Genetics. 177・2. 519-532 (2001)》

Nabeshima, K., Kakihara, Y., Hiraoka, Y., Nojima, H.: "A novel meiosis-specific protein of fission yeast Meu13p, promotes homologous pairing independently of homologous recombination"EMBO Journal. 20・14. 3871-3881 (2001)

Nabeshima, K.、Kakihara, Y.、Hiraoka, Y.、Nojima, H.：“裂殖酵母 Meu13p 的新型减数分裂特异性蛋白，促进独立于同源重组的同源配对”EMBO 杂志 3871-3881。 (2001)

Fujii, T., Tamura, K., Masai, K., Tanaka, H., Nishimune, Y., Nojima, H.: "Use of stepwise subtraction to comprehensively isolate mouse genes whose transcription is upregulated during spermiogenesis"EMBO Report. 3・4. 367-372 (2002)

Fujii, T.、Tamura, K.、Masai, K.、Tanaka, H.、Nishimune, Y.、Nojima, H.：“使用逐步减法全面分离在精子发生过程中转录上调的小鼠基因”EMBO 报告。 3・4。367-372（2002）