がんの免疫遺伝子治療への応用をめざしたEBウイルスベクターの開発

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腫瘍特異抗原遺伝子を挿入したEBウイルスを作製するための前段階として、本年度は、約170キロベースものサイズを持つEBウイルスゲノムを目的に応じて自在に改変するためのシステムの確立を目標とした。この目的でバーキットリンパ腫由来の細胞株であるAkata細胞内に存在するEBウイルスゲノムにBAC(Bacterial Artificial Chromosome、大腸菌人工染色体)ベクター配列を挿入したBACクローン(AK-BAC)を利用した。AK-BACは大腸菌内で増殖させることが可能であり、また大腸菌内で相同組換え法により迅速に改変できるという特徴を有している。実際に大腸菌内における相同組換え法を用いて、GFP遺伝子をAK-BACのB95-8株欠失領域に正確に組み込むことに成功した。この際に、EBウイルスゲノムのリピート配列などはコピー数が変化することなく安定に維持された。得られたBACクローン(AK-BAC-GFP)のDNAを大腸菌で大量調製し、Akata細胞に電気穿孔法により再導入することにより、ウイルス産生細胞を作製した。この細胞を抗イムノグロブリン抗体で処理することにより、GFP遺伝子が組み込まれた組換えEBウイルスを産生し、Bリンパ球に感染させた。その結果、Bリンパ球は不死化して、GFP蛋白質を発現する不死化Bリンパ球細胞株(lymphoblastoid cell line、LCL)が樹立された。得られたLCLのウイルス遺伝子発現パターンは、野生型と同様であった。以上の結果より、AK-BACを用いたウイルスゲノム改変システムにより、腫瘍特異抗原を発現するLCLを作製し、これを用いた免疫遺伝子治療へと応用していくことが可能と考えられた。