次世代マイクロチップを用いた単一リンパ球機能のハイスループット解析法の開発

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本研究は、我々が世界で初めて開発した「リンパ球チップ」をさらにブラッシュアップし、感染症患者の血液から病原菌特異的なヒトBリンパ球を効率良く同定し、そのBリンパ球が産生する抗体遺伝子を迅速に単離し、ヒト型リコンビンナント抗体を1週間以内に作製することで、新興感染症や細菌を用いた生物テロに対する世界最速の感染症治療戦略に貢献することを目指す。平成21年度の研究実績は以下のとおりである。【1】リンパ球チップの改良:マイクロアレイスキャナーを2蛍光対応型に改良し、2つの異なるカルシウム蛍光色素を用い、正確な陽性細胞の検出する系を確立した。また、CCDカメラを用いた新しいマイクロアレイスキャナーの開発を行った。すなわち、抗原刺激後、10mSec毎、3分間、細胞蛍光強度を撮影し、その蛍光強度のデータをコンピューターで解析することが可能となった。このことで、抗原濃度や抗原のエピトープ数さらに抗原受容体の数や親和性等によって規定される細胞刺激の強弱に対するリンパ球クローンの反応差を確認することが可能となり、抗原特異的リンパ球の正確な検出率が大幅に改善した。【2】ヒト型抗体が認識するHBs抗原エピトープの決定:B型肝炎ウイルス(HBV)の感染には、HBVのエンベロープ蛋白が関与するが、ヒト抗体が認識できる部位(抗原エピトープ)についての詳細な検討はなされていない。今回、リンパ球チップで作成した多くのHBVに対するヒト型モノクローナル抗体を用いて、抗原エピトープの解析を行った。HBs抗原は226のアミノ酸からなり、抗原決定基aはアミノ酸配列はすでに報告されているので、ポリペプチド(約15アミノ酸)を新たに合成し、各々のペプチドに結合し得る抗体(競合実験を含む)を調べることで、HBV中和能との連関を明らかにすることができた。