ヒトリンパ球の発生分化におけるRAGとホメオボックス遺伝子の発現と機能

RAG和同源盒基因在人淋巴细胞发育和分化过程中的表达和功能

• 批准号: 05807028
• 负责人: 村口 篤
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Toyama Medical and Pharmaceutical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05807028/
• 关键词: リンパ球; 発生分化; 組み換え活性化遺伝子; ストローマ細胞; ホメオボックス遺伝子; 特異的結合配列

(1)ヒト組み換え活性化遺伝子(RAG)発現誘導に関する研究(1)ヒトRAG-1mRNA発現の微量測定法の確立:RT-PCR法によるヒトRAG-1 mRNAの高感度かつ特異的検出法を確立した。この系を用いて、正常細胞・血液系細胞株におけるRAG-1 mRNAの発現を検討したところ、胸腺・骨髄細胞・pre-B株(Nalm-6)・T細胞株(CEM)などの未熟細胞にRAG-1が発現していることが明らかになった。また、我々の樹立した胎児肝由来リンパ球様細胞株(FL)においてはその発現は見られず、FLがRAGを発現する以前の前駆細胞であることが確認された。(2)FL細胞(未熟リンパ球株)のRAG発現誘導:マウス骨髄由来のストローマ細胞株(PA6)、ヒト骨髄由来ストローマ細胞株(RASV-5)をFL細胞を共培養することで、FLにRAG-1 mRNAの発現が誘導された。この発現誘導には、ストローマ細胞との直接接触が必要であること、またある種のサイトカインがこの誘導を増幅することを明らかにした。サイトカインとしては、IL-3,IL-6,IL-7が重要であることを明らかにした。(2)ホメオボックス蛋白の特異的DNA結合配列の決定ホメオボックス遺伝子(HB24)cDNAを用いて、in vitro translation kitでHB24蛋白を合成し、可能性ある全degenerativeオリゴヌクレオチドに対してゲルシフトアッセイを行った。ゲルから結合断片を回収し、PCRにより増幅するという行程を3回繰り返し、シークエンス特異的に結合すると考えられるヌクレオチドプールを得た。これをブルースクリプトベクターを用いてサブクローニングし、大腸菌にトランスフォームして得られたプラスミド(31種類)の塩基配列を決定した。その結果、24種のプラスミドDNAが同一のコンセンサス配列(7塩基配列)を含むことを明らかにした。得られた7塩基配列が特異的結合配列であることは、変異ヌクレオチドを用いたゲルシフトアッセイにて確認した。

(1) Research on the induction of ヒトRAG-1 mRNA expression and micro-assay: RT-PCR method によるヒトRAG-1 The high sensitivity and specific extraction method of mRNA has been established.この-line をいて, normal cell and blood cell line におけるRAG-1 mRNAの発成を検検したところ, thymus, bone marrow cells, pre-B strain (Nalm-6)・T cell line (CEM) などの immature cells にRAG-1 が発appear していることが明らかになった.また、I established the したfetal liver cell line (FL) from which the fetal liver originated and the においてはその発は见られず、FLがRAGを発appears する前の前槆 cells であることがconfirm された. (2) RAG expression induction of FL cells (immature リンパ strain): マウススストローマ cell strain (PA6) , ヒトトローマ cell line (RASV-5), をFL cells, co-culture することで, FLにRAG-1 The expression of mRNA is induced.この発成には、ストローマcells とのDirect contact is necessary であること、またあるkind のサイトカインがこのinducing を Increase width することを明らかにした.サイトカインとしては、IL-3,IL-6,IL-7がimportant であることを明らかにした. (2) Determination of the specific DNA binding arrangement of ホメオボックスprotein ホメオボックス缝子(HB24) cDNA をいて, in vitro translation kitでHB24 protein is synthesized, and the possibility is fully degenerative.ゲルから Combined fragments を recovery し, PCR により Amplification するという stroke を 3 times 缲り returnし, シークエンス's special に combined with すると卡えられるヌクレオチドプールを got た.これをブルースクリプトベクターを Use いてサブクローニングし, coliform bacteriaランスフォームして得られたプラスミド(31 types)の塩basearrayをdeterminationした. As a result, 24 kinds of のプラスミドDNA are the same のコンセンサス arrangement (7-base arrangement) and the むむことを明らかにした. Obtain the specific binding arrangement of られた7-base arrangement, であることは, and change itヌクレオチドを Use いたゲルシフトアッセイにて to confirm した.

项目成果

Deguchi,Y.: "High Level Expression of the Homeobox Gene,HB24,in a Human T Cell Line Confers the Ability to Form Tumors in Nude Mice." Cancer Res.53. 373-377 (1993)

Deguchi, Y.：“同源盒基因 HB24 在人类 T 细胞系中的高水平表达赋予裸鼠形成肿瘤的能力。”

Kuwahara,K.: "Induction of tyrosine phosphorylation in human B lineage cells by crosslinking MB-1 molecule of B cell receptor-related heterodimer complex." Biol.& Biophy.Res.Comm.197. 1563-1569 (1993)

Kuwahara,K.：“通过交联 B 细胞受体相关异二聚体复合物的 MB-1 分子诱导人 B 谱系细胞中的酪氨酸磷酸化。”

Muraguchi,A.: "Induction of recombination activation gene(RAG)transcription in human lymphoid progenitor cell line by recombinant cytokines and stromal lines." J.Cellular.Biochem.(in press). (1994)

Muraguchi,A.：“重组细胞因子和基质细胞系在人淋巴祖细胞系中诱导重组激活基因 (RAG) 转录。”

Ichigi,Y.: "Generation of cells with morphological and antigenic progenitor cells derived from human fetal liver." Cellular Immunol.149. 193-207 (1993)

Ichigi,Y.：“具有源自人胎儿肝脏的形态和抗原祖细胞的细胞的产生。”