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TLR発現制御におけるCFTR遺伝子変異の影響と分子シャペロンの役割

CFTR基因突变的影响及分子伴侣在调节TLR表达中的作用

基本信息

批准号：
15019083
负责人：
甲斐広文
金额：
$ 3.33万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.転写レベルでのTLR発現制御機構の解明最近,我々は,CFTRに変異を持つ嚢胞性線維症(Cystic Fibrosis : CF)患者由来の上皮細胞において,TLR2,TLR4およびMD-2の発現量が先天的に上昇していることを見出し,CF患者において細菌感染による炎症応答反応が増強することを明らかにした.本年度は,どのようなメカニズムでTLR2の発現が上昇しているかについて検討した.その結果,DNAメチル化阻害剤である5-azacytidineを用いた実験から,CF細胞におけるTLR2の発現上昇にはTLR2遺伝子プロモーター領域のDNAメチル化が関与していることが示唆された.以上の結果より,CFTR遺伝子変異によって細胞内のepigeneticな遺伝子変化が引き起こされTLR2遺伝子の発現上昇が起こり,その結果,細菌感染による炎症反応の増強が起こりやすくなる可能性が示唆された.2.タンパク翻訳後レベルでのTLR発現制御機構の解明N型糖鎖を認識しさまざまなタンパク質のプロセッシングに関与しているER分子シャペロンCalnexin, Calreticulinのアデノウイルス発現系(Ad-CNX, Ad-CRT)を構築した.また,TLR4-WTおよびTLR4-299/399(細胞膜上に発現しないTLR4の変異体)の細胞内挙動を検討するためのGFP融合タンパク発現ベクターの作製を行った.さらに,TLR4,TLR4/MD-2,TLR4/MD-2/CD14をexogenousに恒常的発現するCHO細胞およびTLR4-YFP, TLR4-YFP/MD-2をexogenousに発現するHEK293細胞を入手し,各種実験を開始した.現在までのところ,免疫蛍光法および免疫沈降法を用いた実験の結果,TLR4の細胞内プロセッシング機構にCNX, CRTの両分子が関与している可能性を示唆するデータを得ている.次に,LPS処理によって引き起こされるTLR4 endocytosisが,どのような経路を介して起こるかを検討した.その結果,nystatin処理によってTLR4 endocytosisは阻害され,chlorpromazineによって阻害されなかった.したがって,TLR4 endocytosisはcaveolaeを介した経路で起こることが示唆された.

Recently, we have found that CFTR is different from cellular Fibrosis (CF), and the expression of TLR2, TLR4 and MD-2 is inherently increased in CF patients. This year, the occurrence of TLR2 has increased. As a result, the presence of TLR2 in CF cells increased with the use of 5-azacytidine, and the presence of TLR2 in CF cells increased with the use of 5-azacytidine. As a result,CFTR gene expression was significantly different from that of TLR2 gene expression. The possibility of increased inflammatory response caused by pathogenic bacteria was demonstrated. 2. The mechanism of TLR expression was identified and the N-type carbohydrate lock was identified. The relationship between ER expression and Calnexin, Calretinin expression system (Ad-CNX, Ad-CRT) was constructed. In addition, the GFP fusion gene was used to control the intracellular movement of TLR4-WT and TLR4-299/399(a variant of TLR4 that occurs on cell membranes). In addition, CHO cells and HEK293 cells with TLR4, TLR4/MD-2, TLR4/MD-2/CD14 were exogenously and constantly developed. Now, the results of immunoluminescence and immunoprecipitation show that the intracellular mechanism of TLR4 is related to CNX and CRT molecules. In addition,LPS treatment was initiated by TLR4 endocytosis, and the pathway was initiated by LPS treatment. As a result,nystatin treatment caused TLR4 endocytosis,chlorpromazine caused TLR 4 endocytosis. TLR4 endocytosis caveolae in the middle of the road.