神経伝達物質による細胞増殖,分化機構の研究

神经递质诱导细胞增殖和分化机制的研究

• 批准号: 08878147
• 负责人: 宮本 英七
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 1997
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08878147/
• 关键词: CAKβ; Pyk2; チロシンキナーゼ; MAPキナーゼ; カルシウムイオン; CaMキナーゼII; 遺伝子組替え実験; 初代培養神経細胞; グルタミン酸受容体; 遺伝子組換え実験; 培養細胞

生後1日目ラット脳海馬を採取し,細胞を分離して初代培養神経細胞を調製した。7〜8日間培養した後実験に使用した。グルタミン酸刺激に反応してMAPキナーゼ活性化反応が観察された。MAPキナーゼ活性化反応は,Ca^<2+>依存性経路とプロテインキナーゼC (PKC)活性化反応を解する経路の総和として惹起されていることが明らかになった。一方,グルタミン酸刺激は燐酸化チロシン残基の増強をもたらすことが報告された。本研究では,Ca^<2+>を介するMAPキナーゼ活性化反応にチロシンキナーゼの関与を検索するために計画された。標的チロシンキナーゼは細胞質に存在し,Ca^<2+>依存症に活性化されるCAKβ/Pyk2である。1)イムノブロット法で,CAKβ/Pyk2は,ラット脳海馬初代培養神経細胞,PC12細胞に存在していた。2)海馬初代培養神経細胞をあらかじめ[^<32>P]燐酸でATPをラベルし,グルタミン酸を投与して刺激した。反応を液体窒素で固定した後,ホモジェナイズしてCAKβ/Pyk2を免疫沈殿させた。免疫複合体を,SDS-PAGEついでオートラジオグラフィーで調べると,CAKβ/Pyk2に燐酸化反応有意に上昇していた。3)海馬初代培養神経細胞をグルタミン酸投与によって刺激し,反応停止後ホモジェナイズしてCAKβ/Pyk2に対する抗体を用いて免疫沈殿した。沈殿物のチロシンキナーゼ活性をポリ(glu,tyr)を基質として測定すると,活性の上昇が見られた。4)in vitroの実験で,組替え遺伝子実験法によって得られた全長の組替えGST-CAKβは,別に精製したCaMキナーゼIIによって燐酸化された。PKCは燐酸化することができなかった。CAKβチロシンキナーゼ活性を測定すると,CaMキナーゼII燐酸化反応の有無にかかわらず,CAKβ活性には変化が見られなかった。現在,in situとin vitro燐酸化反応における酵素活性に及ぼす影響について検索している。

On the first day after birth, the ラット脳 hippocampus を was collected, and the cells were を isolated and て cultured. The primary cells were を modulated and <s:1> た was carried out. After 7 to 8 days of training of た, the laboratory に uses た. グ ル タ ミ ン acid stimulation に anti 応 し て MAP キ ナ ー ゼ activeness anti 応 が 観 examine さ れ た. MAP キ ナ ー ゼ activeness anti 応 は, Ca ^ 2 + < > dependency 経 road と プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ C (PKC) activity against 応 を solution す る 経 road の 総 and と し て provoked さ れ て い る こ と が Ming ら か に な っ た. One side,グ グ タ タ, <s:1>, acidation-stimulated <s:1>, phosphylation, チロシ, <s:1> residue <s:1> enhancement を たらす, たらす, とが report された. This study で は, Ca ^ 2 + > < を interface す る MAP キ ナ ー ゼ activeness anti 応 に チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ の masato and を 検 cable す る た め に project さ れ た. The target チロシ キナ キナ ゼ ゼ に exists in the cytoplasm に,Ca^<2+> dependency に activation されるCAKβ/Pyk2である. 1) イ ム ノ ブ ロ ッ で ト method, CAK beta/Pyk2 は, ラ ッ ト 脳 hippocampal trainees resting to restore energy 経 cells at the beginning of PC12 cells exist に し て い た. 2) at the beginning of the hippocampus trainees resting to restore energy 経 cells を あ ら か じ め [^ < > 32 P] 燐 acid で ATP を ラ ベ ル し, グ ル タ ミ ン acid を cast with し て stimulus し た. After immobilizing <s:1> た with anti応 を liquid nitrogen で,ホモジェナ ズ ズ てCAKβ/Pyk2を immunizes させた. Immune complex を, sds-page つ い で オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ ィ ー で adjustable べ る と, CAK beta/Pyk2 に 燐 acidification anti 応 intentionally に rise し て い た. 3) at the beginning of the hippocampus trainees resting to restore energy 経 cells を グ ル タ ミ ン cast with acid に よ っ て stimulate し, anti 応 stopped ホ モ ジ ェ ナ イ ズ し て CAK beta/Pyk2 に す seaborne を る antibody with い て immune Shen Dian し た. Shen Dian content の チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ active を ポ リ (glu, tyr) を matrix と し て determination す る と, active rise の が see ら れ た. 4) in vitro の be 験 で, group for え heritage 伝 son be 験 method に よ っ て have ら れ た length for え GST - CAK beta は の group, don't に refined し た CaM キ ナ ー ゼ II に よ っ て 燐 acidification さ れ た. PKC する phosphodification する な な な った った. CAK beta チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ activity determination of を す る と, CaM キ ナ ー ゼ II 燐 acidification anti 応 の presence of に か か わ ら ず, CAK beta activity に は variations change が see ら れ な か っ た. Now,in situとin vitro phosphorescated anti応 における enzyme activity に and ぼす effects に て て て検 て検 on て て る る.

项目成果

E.Miyamoto: "A role of Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II in the induction of long-term potentiation in hippocampal CA1 area" Neurosci.Res.24. 117-122 (1996)

E.Miyamoto：“Ca^2/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II在海马CA1区长期增强诱导中的作用”Neurosci.Res.24。

御子柴克彦: "細胞内カルシウムホメオスタシスと細胞機能" 細胞工学. 16. 10-15 (1997)

Katsuhiko Mikoshiba：“细胞内钙稳态和细胞功能”《细胞工程》16. 10-15 (1997)。

宮本英七: "細胞内情報伝達系と可塑性" CLINICAL NEUROSCIENCE. 16. 1119-1121 (1997)

Eishichi Miyamoto：“细胞内信号转导系统和可塑性”临床神经科学。16。1119-1121（1997）。

Masanobu Sugimura: "DY-9760e, a novel calmodulin antagonist with cytoprotective action" Eur.J.Pharmacology. 336. 99-106 (1997)

Masanobu Sugimura：“DY-9760e，一种具有细胞保护作用的新型钙调蛋白拮抗剂”Eur.J.Pharmacology。

S.Yano: "Regulation of CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) family members by stimulation of glutamate receptors in cultured rat cortical astrosytes" J.Biol.Chem.271. 23520-23527 (1996)

S.Yano：“通过刺激培养的大鼠皮质星形细胞中的谷氨酸受体来调节 CCAAT/增强子结合蛋白 (C/EBP) 家族成员”J.Biol.Chem.271。