神経伝達物質による細胞増殖,分化機構の研究

神经递质诱导细胞增殖和分化机制的研究

• 批准号: 08878147
• 负责人: 宮本 英七
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 1997
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08878147/
• 关键词: CAKβ; Pyk2; チロシンキナーゼ; MAPキナーゼ; カルシウムイオン; CaMキナーゼII; 遺伝子組替え実験; 初代培養神経細胞; グルタミン酸受容体; 遺伝子組換え実験; 培養細胞

生後1日目ラット脳海馬を採取し,細胞を分離して初代培養神経細胞を調製した。7〜8日間培養した後実験に使用した。グルタミン酸刺激に反応してMAPキナーゼ活性化反応が観察された。MAPキナーゼ活性化反応は,Ca^<2+>依存性経路とプロテインキナーゼC (PKC)活性化反応を解する経路の総和として惹起されていることが明らかになった。一方,グルタミン酸刺激は燐酸化チロシン残基の増強をもたらすことが報告された。本研究では,Ca^<2+>を介するMAPキナーゼ活性化反応にチロシンキナーゼの関与を検索するために計画された。標的チロシンキナーゼは細胞質に存在し,Ca^<2+>依存症に活性化されるCAKβ/Pyk2である。1)イムノブロット法で,CAKβ/Pyk2は,ラット脳海馬初代培養神経細胞,PC12細胞に存在していた。2)海馬初代培養神経細胞をあらかじめ[^<32>P]燐酸でATPをラベルし,グルタミン酸を投与して刺激した。反応を液体窒素で固定した後,ホモジェナイズしてCAKβ/Pyk2を免疫沈殿させた。免疫複合体を,SDS-PAGEついでオートラジオグラフィーで調べると,CAKβ/Pyk2に燐酸化反応有意に上昇していた。3)海馬初代培養神経細胞をグルタミン酸投与によって刺激し,反応停止後ホモジェナイズしてCAKβ/Pyk2に対する抗体を用いて免疫沈殿した。沈殿物のチロシンキナーゼ活性をポリ(glu,tyr)を基質として測定すると,活性の上昇が見られた。4)in vitroの実験で,組替え遺伝子実験法によって得られた全長の組替えGST-CAKβは,別に精製したCaMキナーゼIIによって燐酸化された。PKCは燐酸化することができなかった。CAKβチロシンキナーゼ活性を測定すると,CaMキナーゼII燐酸化反応の有無にかかわらず,CAKβ活性には変化が見られなかった。現在,in situとin vitro燐酸化反応における酵素活性に及ぼす影響について検索している。

在生命的第一天收集大鼠脑海马，并分离细胞以制备原发性培养的神经元。进行培养7-8天，然后在实验中使用。对谷氨酸刺激的响应观察到了MAP激酶激活反应。已经揭示了MAP激酶激活反应被诱导为CA^<2+> - 依赖性途径的总和，以及散布蛋白激酶C（PKC）活化反应的途径。另一方面，据报道，谷氨酸刺激导致磷酸化酪氨酸残基的增强。在这项研究中，计划寻找酪氨酸激酶参与Ca^<2+> - 介导的MAP激酶激活反应。靶酪氨酸激酶是CAKβ/PYK2，它存在于细胞质中，并被Ca^<2+>成瘾激活。 1）通过免疫印迹，大鼠脑海马和PC12细胞中的原发性神经元中存在CAKβ/PYK2。 2）将原发性培养的海马神经元用[^<32> p]磷酸盐预先标记，并通过施用谷氨酸刺激。用液氮固定反应，然后均质化以免疫沉淀CAKβ/PYK2。当通过放射自显影后，然后进行SDS-PAGE检查免疫复合物时，磷酸化反应显着增加到CAKβ/PYK2。 3）用谷氨酸施用刺激原发性海马神经元，并使用针对CAKβ/PYK2的抗体停止，匀浆和免疫沉淀。使用聚（Glu，Tyr）作为底物测量沉淀的酪氨酸激酶活性，并观察到活动的增加。 4）在体外实验中，通过单独纯化的CAM激酶II磷酸化，通过重组基因实验方法获得的全长重组GST-CAKβ被磷酸化。 PKC无法磷酸化。当测量CAKβ酪氨酸激酶活性时，无论是否存在CAM激酶II磷酸化反应，CAKβ活性都没有观察到变化。目前，我们正在寻找对原位和体外磷酸化反应中酶活性的影响。

项目成果

E.Miyamoto: "A role of Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II in the induction of long-term potentiation in hippocampal CA1 area" Neurosci.Res.24. 117-122 (1996)

E.Miyamoto：“Ca^2/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II在海马CA1区长期增强诱导中的作用”Neurosci.Res.24。

宮本英七: "シナプス伝達効率の調節と蛋白質燐酸化,脱燐酸化反応.分子から高次脳機能へ、脳の階層性をふまえて.(二木宏明、田中啓治、宮本英七、佐武明、中辻憲夫・編集)" 共立出版社, 9 (1996)

Eishichi Miyamoto：“突触传递效率和蛋白质磷酸化和去磷酸化反应的调节。从分子到高级大脑功能，基于大脑的层次结构。”（Hiroaki Niki、Keiji Tanaka、Eishichi Miyamoto、Akira Satake）、Norio Nakatsuji（编辑） .)”共立出版社，9 (1996)

御子柴克彦: "細胞内カルシウムホメオスタシスと細胞機能" 細胞工学. 16. 10-15 (1997)

Katsuhiko Mikoshiba：“细胞内钙稳态和细胞功能”《细胞工程》16. 10-15 (1997)。

宮本英七: "細胞内情報伝達系と可塑性" CLINICAL NEUROSCIENCE. 16. 1119-1121 (1997)

Eishichi Miyamoto：“细胞内信号转导系统和可塑性”临床神经科学。16。1119-1121（1997）。

S.Yano: "Regulation of CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) family members by stimulation of glutamate receptors in cultured rat cortical astrosytes" J.Biol.Chem.271. 23520-23527 (1996)

S.Yano：“通过刺激培养的大鼠皮质星形细胞中的谷氨酸受体来调节 CCAAT/增强子结合蛋白 (C/EBP) 家族成员”J.Biol.Chem.271。