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神経伝達物質による細胞増殖,分化機構の研究

神经递质诱导细胞增殖和分化机制的研究

基本信息

批准号：
08878147
负责人：
宮本英七
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至 1997
项目状态：
已结题

项目摘要

生後1日目ラット脳海馬を採取し,細胞を分離して初代培養神経細胞を調製した。7〜8日間培養した後実験に使用した。グルタミン酸刺激に反応してMAPキナーゼ活性化反応が観察された。MAPキナーゼ活性化反応は,Ca^<2+>依存性経路とプロテインキナーゼC (PKC)活性化反応を解する経路の総和として惹起されていることが明らかになった。一方,グルタミン酸刺激は燐酸化チロシン残基の増強をもたらすことが報告された。本研究では,Ca^<2+>を介するMAPキナーゼ活性化反応にチロシンキナーゼの関与を検索するために計画された。標的チロシンキナーゼは細胞質に存在し,Ca^<2+>依存症に活性化されるCAKβ/Pyk2である。1)イムノブロット法で,CAKβ/Pyk2は,ラット脳海馬初代培養神経細胞,PC12細胞に存在していた。2)海馬初代培養神経細胞をあらかじめ[^<32>P]燐酸でATPをラベルし,グルタミン酸を投与して刺激した。反応を液体窒素で固定した後,ホモジェナイズしてCAKβ/Pyk2を免疫沈殿させた。免疫複合体を,SDS-PAGEついでオートラジオグラフィーで調べると,CAKβ/Pyk2に燐酸化反応有意に上昇していた。3)海馬初代培養神経細胞をグルタミン酸投与によって刺激し,反応停止後ホモジェナイズしてCAKβ/Pyk2に対する抗体を用いて免疫沈殿した。沈殿物のチロシンキナーゼ活性をポリ(glu,tyr)を基質として測定すると,活性の上昇が見られた。4)in vitroの実験で,組替え遺伝子実験法によって得られた全長の組替えGST-CAKβは,別に精製したCaMキナーゼIIによって燐酸化された。PKCは燐酸化することができなかった。CAKβチロシンキナーゼ活性を測定すると,CaMキナーゼII燐酸化反応の有無にかかわらず,CAKβ活性には変化が見られなかった。現在,in situとin vitro燐酸化反応における酵素活性に及ぼす影響について検索している。

1 day after birth, hippocampus cells were isolated and cultured in vitro. 7 ~ 8 days of cultivation after use The reaction to acid stimulation was observed in MAP. MAP activation pathway,Ca^<2+> dependent pathway, C (PKC) activation pathway and activation pathway. In one case, the increase in phosphorylated residues was reported by acid stimulation. This study was conducted in the context of Ca <2+>-induced MAP activation. The target is CaKβ/Pyk2, which is activated by Ca^<2+> dependence. 1) CAKβ/Pyk2 was detected in hippocampal primary cultured neurons and PC12 cells by the method of ". 2)Hippocampus primary cultured <32>neurons were stimulated with ATP and phosphate. After the anti-inflammatory agent is immobilized, the CAKβ/Pyk2 antibody is isolated. When the immune complex is activated,SDS-PAGE can be adjusted, and the phosphorylation reaction of CAKβ/Pyk2 is intentionally increased. 3)Hippocampus primary cultured neurons were stimulated by acid, and the antibody against CAKβ/Pyk2 was used after the reaction was stopped. The activity of the substrate was measured and increased. 4)In vitro, the total length of GST-CAKβ was obtained by the method of synthesis of GST-CAKβ, and the phosphorylation of GST-CAKβ was obtained by the method of synthesis of GST-CAKβ. PKC is acidic. CAKβ phosphorylation activity was determined. Now,in situ and in vitro phosphorylation reactions are involved in enzyme activity and enzyme effects.