Identifizierung und Charakterisierung der Arg-100-Transferrinrezeptor-Sheddingprotease

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Der Transferrinrezeptor (TfR) vermittelt über Bindung und Internalisierung des Eisentransportproteins Transferrin die Eisenaufnahme in die Zelle. Die extrazelluläre Domäne des humanen membranständigen TfR kann durch proteolytische Spaltung Cterminal von Arg-100 ins Serum freigesetzt werden, wo sie als 660 Aminosäuren großer Serum-TfR vorkommt. Es wird vermutet, daß der Sheddingprozeß eine wesentliche Rolle für die Regulation der Zahl der TfR-Moleküle an der Zelloberfläche spielt. Die das Shedding katalysierende Protease ist bisher jedoch nicht bekannt. Ziel ist es, die TfR-Shedding-Protease zu identifizieren, zu reinigen, zu klonieren und funktionell zu charakterisieren. Zunächst soll die Protease mit verschiedenen Methoden wie der Affinitätschromatographie über immobilisierte, reversibel bindende Inhibitoren gereinigt und N-terminal sequenziert werden. Durch die Immunisierung von Mäusen sollen monoklonale Antikörper gewonnen werden. Unter Verwendung degenerierter Primer soll die cDNA der Protease mittels RT-PCR, EST-Datenbankvergleich sowie 3'- und 5'-RACE identifiziert werden. Alternativ soll die cDNA durch DNA-Hybridisierung oder Expressionsklonierung aus cDNA-Banken isoliert werden. Die Funktionen der Protease, ihre Regulation und ihre Lokalisation sollen anschließend im Zellkulturmodell und an Gewebeschnitten umfassend analysiert werden.