がん遺伝子産物の機能とそのカスケードの解析

癌基因产物及其级联的功能分析

基本信息

批准号：
63015061
负责人：
清水憲二
金额：
$ 6.78万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.抗raf抗体の製作:ヒトc-rafのC末側31kdの蛋白を大腸菌で発現させ、95%以上の純標品数mgを精製した。これをウサギに免疫し、31kd蛋白を認識するポリクローナル抗体を得た。本抗体は活性raf形質転換細胞に特異的な約70kdの蛋白を認識する。2.条件形質転換:活性H-ras遺伝子をMMTVプロモーターに連結し、ホルモンによる条件形質転換の系を確立した。ホルモン誘導後、H-rasのmRNAの発現とほぼ同時に、c-fosのmRNAの発現が開始されることを見出した。また、それ以降の時間に条件形質転換細胞で特異的に発現するmRNAのcDNAクローンをを分離しつつある。3.Cキナーゼの変化:二次元電気泳動による解析から、ras、raf形質転換細胞ではCキナーゼによる80kd蛋白の燐酸化が消失していること、この現象が条件形質転換の系でも再現されたので形質転換に密接に関連していること、などが判った。in vitroでの解析により、この現象はCキナーゼの膜分画への移行による結果と推察された。4.分子遺伝学的解析:多コピーのヒト活性N-rasによる形質転換細胞から、癌遺伝子を保持しつつ非形質転換の表現型を示す復帰変異株を、(1)EMS処理、(2)neo^R遺伝子の挿入。(3)ヒト高分子DNAの移入などの方法により多数分離した。(1)、(2)の群には劣性変異のものがあり、少なくとも3種の相補性群を含むことを見出した。特に、neo^R遺伝子の単一コピーの挿入による変異株からは、ras蛋白の作用する機能連鎖中に介在する未知の遺伝子を同定、分離することが可能となった。また(3)の群にはヒト腫瘍抑制遺伝子を含んでいる可能性があり、クローニングの試みを進めている。以上のほか、(2)の系をヒト癌細胞に適用して未知の癌遺伝子を検出する試みや、特定の遺伝子mRNAを特異的に破壊する新しい方法の検討なども併せて進行中である。

1。抗RAF抗体的制备：在大肠杆菌中表达了人C-RAF的C末端31KD的蛋白质，并纯化了95％或更多的几毫克纯制剂。这是对兔子免疫的，以获得识别31KD蛋白的多克隆抗体。该抗体识别大约70 kD的蛋白质特异性针对活性RAF转化细胞。 2。条件转化：主动H-RAS基因与MMTV启动子相关联，以建立用激素有条件转化的系统。发现C-FOS mRNA的表达几乎与激素诱导后H-RAS mRNA的表达同时启动。此外，在条件转化细胞中特异性表达的mRNA的cDNA克隆开始在随后的时间分离出来。 3。c激酶的变化：通过二维电泳分析表明，在RAS和RAF转化的细胞中，C激酶对80KD蛋白的磷酸化消失，并且在条件转化的系统中也重现了这种现象，因此与转化密切相关。体外分析表明，这种现象是C激酶向膜馏分过渡的结果。 4。分子遗传分析：从具有多个人类活性N-RAS的转化细胞中，携带癌基因并表现出非转化表型的可逆菌株是（1）EMS处理，以及（2）插入Neo^r基因。（3）许多通过诸如引入人类聚合物DNA的方法分离。发现组（1）和（2）包含隐性突变，并且至少包含三个互补组。特别是，已经有可能识别和分离在功能连锁中介导的未知基因，其中RAS蛋白起作用，与由Neo^r基因的单个拷贝插入引起的突变体引起的突变体。此外，（3）组可能包含人类肿瘤基因，并进行克隆尝试。除上述内容外，还尝试使用系统（2）对人类癌细胞检测未知的癌基因，并且还在进行有关特殊破坏特定基因mRNA的新方法的研究。