がん遺伝子産物の機能とそのカスケードの解析

癌基因产物及其级联的功能分析

基本信息

批准号：
01015075
负责人：
清水憲二
金额：
$ 4.48万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.抗RAF抗体:大腸菌で発現させ、精製したcーRAF蛋白の一部(31kd)を抗原として、抗RAFマウスモノクローナル抗体を作成した。得られた14種の抗体は免疫ブロットや免疫沈降の結果から少なくとも4種のエピトープ認識群に分類できた。細胞分画と免疫ブロットにより、正常cーRAF蛋白(74kd)はほとんど可溶性分画に分布するのに対し、融合型活性RAF蛋白は圧倒的に膜分画に局在することが判明した。また、最も特異的な抗体を用いて、主に核分画に局在する新しいRAF関連蛋白(56kd)を見出した。これらの抗体を用いることにより、cーRAF蛋白と相互作用をする蛋白の同定、cーRAF蛋白のキナーゼ活性の変化やリン酸化による活性調節を追求する道が開かれた。2.活性ras経路で発現の変化するcDNA:ホルモンによるras条件形質転換の系において、活性ras発現開始後の5時間で発現が上昇するcDNAクローン4種、減少するクローン1種を分離した。これらはいずれも比較的コピー数の多いmRNAに対応しているので、構造蛋白の遺伝子産物と思われる。3.cDNA発現ライブラリー:染色体DNAの移入による遺伝子の検索は、約70キロ塩基対までの遺伝子に限定されていた。そこで高能率のcDNAライブラリー構築と高発現を同時に満たす新しいlambdaファージベクターを開発した。これは13kbpまでのcDNAを強力な真核生物プロモーターの下流に挿入でき、しかもベクター単独では増殖できないという特長がある。更にベクター内にハイグロマイシン耐性マーカーを組込んであるため、DNA移入細胞を選抜することができる。この系による新しい遺伝子の検索を今後推進したい。4.その他:ハイグロマイシン耐性遺伝子との共移入によって、ヒト胃癌、肝癌、リンパ腫などからrasと異なる活性トランスフォーミング遺伝子を少なくとも3例検出した。それらのクローニングと実体の解明を開始する。

1。抗-RAF抗体：使用在大肠杆菌中表达并纯化为抗原的一部分C-RAF蛋白（31KD）制备抗RAF小鼠单克隆抗体。获得的14种抗体可以根据免疫印迹和免疫沉淀结果至少分为4个表位识别组。细胞分馏和免疫印迹表明，正常的C-RAF蛋白（74KD）主要分布在可溶性级分中，而融合活性RAF蛋白则以压倒性地定位于膜分数。此外，最特定的抗体用于发现主要定位于核分裂的新型RAF相关蛋白（56KD）。使用这些抗体为鉴定与C-RAF蛋白相互作用的蛋白质以及追求改变C-RAF蛋白的激酶活性并通过磷酸化来调节活性开辟了道路。 2。在有效RAS途径中具有改变表达的cDNA的RAS系统中，激素，四个具有表达增加的cDNA克隆和一个具有降低表达的克隆的cDNA克隆在活动Ras表达开始后五个小时分离出来。所有这些对应于具有相对较高拷贝数的mRNA，被认为是结构蛋白的基因产物。 3。cDNA表达文库：通过转移染色体DNA搜索基因的搜索仅限于大约70千碱基对的基因。因此，我们开发了一种新的lambda噬菌体载体，同时实现了高效率cDNA库的构建和高表达。这具有一个优点，即可以将高达13 kbp的cDNA插入强大的真核启动子的下游，并且仅载体不能传播。此外，由于毒素耐药性标记物在载体中掺入，因此可以选择DNA转移的细胞。我们希望将来使用该系统促进搜索新基因。 4.其他：在人胃癌，肝癌，淋巴瘤等中检测到与RAS不同的至少三个主动转化基因。我们开始克隆它们并澄清它们的实体。