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ヒト癌細胞からの癌遺伝子の同定と分離

人类癌细胞中癌基因的鉴定和分离

基本信息

批准号：
61210024
负责人：
清水憲二
金额：
$ 6.4万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Special Project Research
财政年份：
1986
资助国家：
日本
起止时间：
1986 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.C-raf-1遺伝子活性化の機構:ヒト固型胃癌DNAより見出された活性raf遺伝子は、全領域クローニングとcDNAの分析によって、正常c-raf-1遺伝子の第6エキソン以降の部分が別のヒト遺伝子の下流に融合し、セリン・スレオニン特異的蛋白リン酸化活性を備えた融合蛋白を作るようになったために活性化されていることが判った。融合部を含むEcoRI断片が独立に得られた複数の初代トランスフォーマントの全てに存在したことから、この融合は元の固型胃癌で生じていたと推察されるが、別のヒト胃癌由来DNA10例を分析した限りでは同様な再配列はなかった。2.c-raf-1遺伝子の遺伝的多型:上記の分析の結果、正常ヒトc-raf-1遺伝子でもエキソン2〜4を含むEcoRI断片にEcoRIに関する制限酵素断片鎖長の多型が検出された。2種の型の頻度は約75%と25%と推定される。3.c-rafcDNAの発現:活性型raf遺伝子は正常c-raf-1蛋白の648アミノ酸残基中キナーゼドメインを含むC端側の454残基に相当するエキソンが含まれている。この融合蛋白の性質を明らかにし、併せてモノクローナル抗体を調製するために、活性rafcDNAを大腸菌で発現させることを試みた。これまでに約60Kdと31Kdの蛋白を発現させる2種のプラスミッドを構築し、蛋白の精製を進めている。4.条件形質転換およびカスケード解析:トランスフォームした細胞の集団から非トランスフォーム細胞を選抜する方法をまず開発した。半固型培地では非トランスフォーム細胞が増殖できない事を利用した【^3H】-チミジン自殺法によってフラットリバータントを濃縮できることができた。この方法によって細胞側の変異によるフラットリバータントの分離・解析や、動物細胞で発現するオンコジーンのcDNAに高温感受性変異を導入することが可能となった。

1. The mechanism of activation of C-raf-1 gene: cDNA analysis of C-raf-1 gene, whole domain DNA analysis, normal C-raf-1 gene, 6th and lower part of C-raf-1 gene, downstream fusion protein, specific protein acidification activity, fusion protein analysis. The fusion part contains EcoRI fragments, which are independent of each other, and all of them exist in solid gastric cancer. 2. Polymorphism of c-raf-1 gene: the results of the analysis above, the normal c-raf-1 gene was detected by PCR 2 ~ 4, and the restriction enzyme fragment length was detected by PCR. The frequency of two types is about 75% and 25% respectively. 3. Development of c-raf cDNA: The active raf cDNA contains the same amino acid residues as the normal c-raf-1 protein at 648 amino acid residues, including residues 454 on the C-terminal side. The properties of this fusion protein are clearly demonstrated, and the expression of active rafcDNA in E. coli is tested. The protein of about 60Kd and 31Kd was developed, and two kinds of protein were constructed and purified. 4. Conditional quality analysis: the method of selecting cells from groups of cells is developed. Semi-solid culture is not the only way to increase the number of cells. This method allows for the isolation and analysis of cell-side variants and the introduction of thermosensitive variants into animal cells.