ヒト癌細胞からの癌遺伝子の同定と分離

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1.C-raf-1遺伝子活性化の機構:ヒト固型胃癌DNAより見出された活性raf遺伝子は、全領域クローニングとcDNAの分析によって、正常c-raf-1遺伝子の第6エキソン以降の部分が別のヒト遺伝子の下流に融合し、セリン・スレオニン特異的蛋白リン酸化活性を備えた融合蛋白を作るようになったために活性化されていることが判った。融合部を含むEcoRI断片が独立に得られた複数の初代トランスフォーマントの全てに存在したことから、この融合は元の固型胃癌で生じていたと推察されるが、別のヒト胃癌由来DNA10例を分析した限りでは同様な再配列はなかった。2.c-raf-1遺伝子の遺伝的多型:上記の分析の結果、正常ヒトc-raf-1遺伝子でもエキソン2〜4を含むEcoRI断片にEcoRIに関する制限酵素断片鎖長の多型が検出された。2種の型の頻度は約75%と25%と推定される。3.c-rafcDNAの発現:活性型raf遺伝子は正常c-raf-1蛋白の648アミノ酸残基中キナーゼドメインを含むC端側の454残基に相当するエキソンが含まれている。この融合蛋白の性質を明らかにし、併せてモノクローナル抗体を調製するために、活性rafcDNAを大腸菌で発現させることを試みた。これまでに約60Kdと31Kdの蛋白を発現させる2種のプラスミッドを構築し、蛋白の精製を進めている。4.条件形質転換およびカスケード解析:トランスフォームした細胞の集団から非トランスフォーム細胞を選抜する方法をまず開発した。半固型培地では非トランスフォーム細胞が増殖できない事を利用した【^3H】-チミジン自殺法によってフラットリバータントを濃縮できることができた。この方法によって細胞側の変異によるフラットリバータントの分離・解析や、動物細胞で発現するオンコジーンのcDNAに高温感受性変異を導入することが可能となった。