ヒト癌細胞からの癌遺伝子の同定と分離

人类癌细胞中癌基因的鉴定和分离

基本信息

批准号：
61210024
负责人：
清水憲二
金额：
$ 6.4万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Special Project Research
财政年份：
1986
资助国家：
日本
起止时间：
1986 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.C-raf-1遺伝子活性化の機構:ヒト固型胃癌DNAより見出された活性raf遺伝子は、全領域クローニングとcDNAの分析によって、正常c-raf-1遺伝子の第6エキソン以降の部分が別のヒト遺伝子の下流に融合し、セリン・スレオニン特異的蛋白リン酸化活性を備えた融合蛋白を作るようになったために活性化されていることが判った。融合部を含むEcoRI断片が独立に得られた複数の初代トランスフォーマントの全てに存在したことから、この融合は元の固型胃癌で生じていたと推察されるが、別のヒト胃癌由来DNA10例を分析した限りでは同様な再配列はなかった。2.c-raf-1遺伝子の遺伝的多型:上記の分析の結果、正常ヒトc-raf-1遺伝子でもエキソン2〜4を含むEcoRI断片にEcoRIに関する制限酵素断片鎖長の多型が検出された。2種の型の頻度は約75%と25%と推定される。3.c-rafcDNAの発現:活性型raf遺伝子は正常c-raf-1蛋白の648アミノ酸残基中キナーゼドメインを含むC端側の454残基に相当するエキソンが含まれている。この融合蛋白の性質を明らかにし、併せてモノクローナル抗体を調製するために、活性rafcDNAを大腸菌で発現させることを試みた。これまでに約60Kdと31Kdの蛋白を発現させる2種のプラスミッドを構築し、蛋白の精製を進めている。4.条件形質転換およびカスケード解析:トランスフォームした細胞の集団から非トランスフォーム細胞を選抜する方法をまず開発した。半固型培地では非トランスフォーム細胞が増殖できない事を利用した【^3H】-チミジン自殺法によってフラットリバータントを濃縮できることができた。この方法によって細胞側の変異によるフラットリバータントの分離・解析や、動物細胞で発現するオンコジーンのcDNAに高温感受性変異を導入することが可能となった。

1。C-RAF-1基因激活的机制：通过全区域克隆和cDNA分析激活了在人类固体胃癌DNA中发现的活性RAF基因，因为外显子6后正常C-RAF-1基因的部分融合了另一种人类基因的下游融合，从而与丝氨酸 - 硫代蛋白 - 硫代蛋白 - 蛋白 - 蛋白 - 蛋白 - 蛋白 - 蛋白 - 蛋白 - 蛋白质蛋白蛋白磷酸化活性。由于所有独立的复数主要转化物中都存在含有融合区域的ECORI片段，因此据估计，这种融合发生在原始的固体胃癌中，但最多分析了从其他人类胃癌中得出的10例DNA，因此没有类似的重排。 2。C-RAF-1基因的遗传多态性：由于上述分析，在正常的人C-RAF-1基因中检测到了含有外显子2-4的ECORI片段限制酶片段链长的多态性。两种类型的频率估计约为75％和25％。 3。c-rafcDNA的表达：活性RAF基因包含一个对应于C端上454个残基的外显子，其中包含正常C-RAF-1蛋白的648个氨基酸残基中的激酶结构域。为了阐明该融合蛋白的特性并制备单克隆抗体，我们试图在大肠杆菌中表达活跃的rafcDNA。到目前为止，已经构建了两个表达约60 kD和31 kD的蛋白质的质粒，并进行了蛋白质纯化。 4。条件转化和级联分析：首先开发了一种从转化细胞种群中选择非转化细胞的方法。平坦的介物可以通过[^3H] - 胸腺定自杀法浓缩，该方法利用了未转化的细胞在半固体培养基中增殖的优势。这种方法使通过细胞侧突变分离和分析平坦的恢复物成为可能，并将高温敏感的突变引入动物细胞中表达的癌基因的cDNA。