Haーrasによって誘導されるエンハンサー結合因子の遺伝子クローニングと機能解析

Haras诱导的增强子结合因子基因克隆及功能分析

基本信息

批准号：
01015041
负责人：
重定勝哉
金额：
$ 3.65万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は、先にポリオーマウイルスエンハンサー中のAエレメントに結合する細胞性因子PEBP2を同定し、その分子的性状がHaーrasによるトランスフォーメーションに際して劇的に変化することを見いだした。そこで本研究ではPEBP2の機能と役割をさらに追究するために本因子の分子的特性解析とcDNAクローニングを次の如く進めた。まずトランスフォーム細胞をヌードマウスに移植して作らせた癌組織を出発材料とし、DNAアフィニティークロマトグラフィーを主体とする方法によりPEBP2の精製を行った。数百匹分の材料を処理することにより、総計数十マイクログラムの純化標品を得ることが出来た。これを用いてアミノ酸配列の決定を行い2ー3の部分配列を得た。この情報を基に現在cDNAクローニングを遂行中である。他方、分子的解析の結果、PEBP3は(i)2種類のサブユニットalphaとbeta(分子量30ー35Kおよび20ー25K)からなるヘテロダイマーである、(ii)alphaとbetaは共にDNA結合活性を持ち、しかもその認識配列は全く同等である。(iii)PEBP2は全体として2価のDNA結合能を持ち、DNAにループ構造を形成させる働きがあるなど種々の特徴的性質を持つことが判った。これらの知見に加えて,PEBP3はポリオーマウイルスエンハンサー上の中心的機能領域であるAおよびBエレメントの双方にほぼ同じ強さで特異的に結合することが見いだされ、同因子がポリオーマウイルスの転写・複製の制御にとって従来予想された以上に重要な役割を果している可能性が示唆された。さらに細胞遺伝子上での役割に関する有力な手がかりとして、発癌遺伝子cーmycの上流域に存在するDNA複製開始信号配列にPEBP3が結合することが見いだされた。

我们先前鉴定了与多瘤病毒增强子中A元素结合的细胞因子PEBP2，并发现其分子特性在Haras转化后发生了巨大变化。因此，在这项研究中，我们进行了该因子的分子表征和cDNA克隆，以便进一步探索PEBP2的功能和作用，如下所示。首先，通过将转化的细胞转化为裸鼠产生的癌组织用作起始材料，PEBP2通过主要由DNA亲和色谱法组成的方法纯化。通过治疗数百只动物，我们能够获得总数数十微克的纯化标本。这用于确定氨基酸序列并获得2-3个子序列。基于此信息，cDNA克隆目前正在进行中。另一方面，分子分析的结果表明，PEBP3是（i）由两个亚基α和β（分子量30-35K和20-25K）组成的异二聚体，以及（ii）α和β都具有DNA结合活性，并且它们的识别序列是完全相等的。（iii）已经发现，PEBP2具有总二价DNA结合能力，并且具有在DNA中形成环结构的能力。除了这些发现外，还发现PEBP3特异性结合了A和B元素，多瘤病毒增强子上的中央功能区域几乎具有相同的强度，这表明该因子在调节多瘤病毒转录和复制的调节中可能具有更重要的作用。此外，作为其在细胞基因中的作用的突出线索，发现PEBP3与存在于致癌基因C-Myc上游区域中的DNA复制起始信号序列结合。