ヒトcーHaーras遺伝子産物の機能発現の分子機構

人c-Haras基因产物功能表达的分子机制

• 批准号: 02152025
• 负责人: 横山 茂之
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Cancer Research
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02152025/
• 关键词: がん遺伝子; cーHaー<ras>___ー遺伝子産物; GTP; PC12細胞; 部位特異的変異; NMR; 安定同位体標識; 高次構造

Rasタンパク質のエフェクタ-部位(32ー40番目,タ-ゲットと相互作用する部位と考えられている)のN末端側およびC末端側の十数アミノ酸残基について部位特異的変異を行い,30種類の変異<ras>___ー遺伝子を作成した.変異<ras>___ー遺伝子をPC12細胞で発現させて形態変化促進活性を調べるとともに,精製した変異Rasタンパク質についてGAPタンパク質によるGTPase活性上昇の程度を調べた.これにより,エフェクタ-部位のN末端側には,GAPタンパク質によるGTPase活性の上昇に関与する残基が,C末端側には,シグナル伝達に必須な残基が存在することが明らかになった.これらの変異Rasタンパク質のうちで,30ー31番目の残基をK<rev>___ーー1タンパク質のものに置換した変異体は,PC12細胞において,発癌性Rasタンパク質の活性を抑制した.この変異体は,Rasタンパク質のタ-ゲットと競合的に結合すると考えられ,今後の解析に有用である.他方,最新のNMRの手法を駆使して,Rasタンパク質の水容液(生理的条件)における高次構造を解析し,X線結晶解析では得られなかった重要な知見が得られた.まず,ランダムな窒素15標識,アミノ酸残基に選択的な窒素15標識およびランダムな炭素13・窒素15二重標識したRasタンパク質を調製し,2次元および3次元NMRの測定を行なった.その結果,GDP結合型Rasタンパク質のほぼ全部のアミノ酸残基についてシグナルを帰属することに成功した.これに基づいて核オ-バ-ハウザ-効果を定量的に解析し,水容液におけるGDP結合型Rasタンパク質の高次構造モデルを作成し,GTP結合型との差異を調べた.特にGTP結合型で,X線解析による結晶化Rasタンパク質の構造との差異が顕著であった.これにより,Rasタンパク質の機能発現(タ-ゲットとの相互作用)に直結する重要な高次構造が明らかになった.

The N-terminal side and C-terminal side of Ras are composed of a number of amino acid residues. The site-specific variation of Ras is composed of 30 different amino acid residues<ras>. The <ras>expression of GTase in PC12 cells is regulated by the regulation of morphological change promoting activity, purification and purification of GTase. N-terminal side of GTase-site, residues related to GTase activity increase, C-terminal side of GTase-site, residues necessary for GTase activity increase. In <rev>PC12 cells, the activity of carcinogenic Ras protein was inhibited by the substitution of K_30 - 31 residues. This is a different approach,Ras de la carte. In addition, the latest NMR techniques have been used to analyze high-order structures and X-ray crystallographic analysis of aqueous solutions (physiological conditions). The 15-carbon 13-carbon 15 double identity was determined by 2D and 3D NMR. As a result, GDP-bound Ras protein was successfully isolated from all the amino acid residues. The quantitative analysis of the basic structure of the GDP-bound Ras in aqueous solution was carried out, and the difference between the GTP-bound Ras and the GTP-bound Ras was modulated. X-ray analysis of the crystalline structure of the GTP-binding type is very important. In this context,Ras de Pueblo's interaction with other important higher-order structures is important.

项目成果

藤田 純子: "<ras>___ー蛋白質の機能構造" 代謝. 27. 79-84 (1990)

Junko Fujita：“<ras>___ - 蛋白质的功能结构”代谢 27. 79-84 (1990)