Ras蛋白質によるターゲット活性化のメカニズム

Ras蛋白激活靶点的机制

• 批准号: 10152208
• 负责人: 横山 茂之
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10152208/
• 关键词: Ras; Raf; X線結晶解析; NMR法; EHドメイン

Rasは互いに一次構造上相同性の見られない多くの因子と相互作用し,活性化する.そこで,それらのターゲット認識・活性化機構の間にどのような共通性や特異性があるのかを明らかにすることをめざした.Raf-1のRas-bindingドメイン(RBD)およびCys-richドメイン(CRD)を含む領域(以下,RBD-CRDと略す)については,大腸菌で大量発現を行い,結晶化を行った.その結果,小さいながらも結晶が得られた.また,脂質修飾を受けたRasについてもSf9細胞より調製し,結晶が得られている.RBD-CRDとGMPPNP結合型ファルネシル化Rasとの共結晶については,未だ結晶は得られていない.今後もひきつづき,検討を行っていきたい.全長のRaf-1については,大腸菌内において,GroELなどのシャペロンと共発現を行い,得られたものとHsp90/50と混合する,といった操作を行ってみたが,安定なタンパク質を得ることに成功していない.さらに,Hsp90/50や14-3-3を共存させた状態で大腸菌抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系を用いた調製を試していきたい.また,Raf-1のRBDに特異的に結合するRNAアプタマーをin vitroセレクション法により人工的に単離した.そして このRNAアプタマーがGST-Raf-1 RBDとRasとの結合を阻害し,その一方,Rasの標的タンパク質であるRGLのRBDとRasとの結合に関しては阻害しないことを確認した.このアプタマーを用いてRaf-1活性化におけるRasの役割をさらに厳密に明らかにしていきたい.また,Rasのシグナル伝達経路の下流に位置する因子であるPOB1(partner of RalBP1)のEH(Eps15 homology)ドメインの水溶液中の立体構造についてNMR法により決定した.

RAS与未显示主要结构同源性的许多因素相互作用并激活。因此，我们旨在阐明其目标识别和激活机制之间存在什么共同点和特异性。 RAF-1的RAS结合域（RBD）和富含Cys的域（CRD）（以下称为RBD-CRD）的区域在大肠杆菌中表达并结晶。结果，获得了晶体，尽管很小，但得到了晶体。还从SF9细胞中制备了已进行脂质修饰的Ras，并获得了晶体。对于与PPNP结合的Farnesyrated Ras的共结晶，RBD-CRD和GM没有晶体。我们将继续进一步调查。对于全长RAF-1，我们与大肠杆菌中的凹槽（例如凹槽）共表达，并与HSP90/50混合，但尚未成功获得稳定的蛋白质。此外，我们将尝试使用无细胞蛋白质合成来制备HSP90/50/50和14-3-3共存的状态中的大肠杆菌提取物。我们还将引入专门结合RAF-1的RBD的RNA适体。通过体外选择方法人为分离RNA适体。据证实，该RNA适体抑制了GST-RAF-1 RBD与RAS的结合，同时又不抑制RBD与Ras的靶蛋白RAS的结合。使用这种适体，我们想进一步阐明RAS在RAF-1激活中的作用。此外，由NMR确定了POB1（RALBP1的伙伴）EH（EPS15同源性）结构域的构象（RALBP1的伴侣），这是RAS信号通路下游的一个因子，由NMR确定。

项目成果

Nureki,O.: "Enzyme structure with two catalytic sites for double-sieve selection of substrates" Science. 280. 578-582 (1998)

Nureki,O.：“具有两个催化位点的酶结构，用于底物的双筛选择”《科学》。