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カルシトニン遺伝子を組み込んだ細胞医薬

整合降钙素基因的细胞药物

基本信息

批准号：
03557110
负责人：
竹内利行
金额：
$ 8.45万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

カルシトニン(CT)は甲状腺C細胞で前駆体として産生され,限定切断反応とアミド化反応をうけて生理活性型CTとなる。これらの反応は内分泌細胞に特徴的で,皮膚細胞,筋肉細胞,リンパ球のような非内分泌細胞ではおこらない。我々は生理活性型CTを適度に分泌する“細胞医薬"を非内分泌細胞を用いて作る目的で,CT遺伝子を上記のような細胞で発現させることを試みている。初年度は,ヒトCT前駆体cDNA中の生理活性CTに相等するDNA部分を,ヒトより50倍生理活性が強いサケCT DNAに置き換えた。次にCT前駆体が内分泌細胞のみならず非内分泌細胞にも広く存在する限定切断酵素Furinの切断反応をうけるように,サケCT部分の両端を4つの連続した塩基性アミノ酸配列をコードするDNAに変異させた。2年度は限定切断反応の効率を上げるため,CTのカルボキシル端(C)に伸びるペプチド部分をDNA配列から切除した。即ちC端はアミド化の基質であるグリシンになった。更にCTのアミノ酸の切断部位も-1位から-4位の塩基性アミノ酸に加えて-6位にアルギニン基を加え,切断効率の向上をはかった。この変異CT DNAを導入したCOS-7は正常CTと同じサイズでC端にグリシンが付加したカルシトニンを産生した。しかしCTが生理活性をもつためには更にグリシンがアミド化反応をうける必要がある。そこでアミド化酵素cDNAをラット脳cDNAライブラリーよりクローニングした。CTを発現させる細胞としてはNIH3T3とCHOを選んだ。NIH3T3は切断酵素Furinを多量に含むがアミド化酵素を含まず,逆にCHOはFurin活性は少ないが,アミド化酵素を多量に含むという特徴がある。3年度はこれらの細胞でCT前駆体がどのようなプロセシングを受けるかを検討した。産生されたCTを2年度に作成したアミド部分に反応する抗体,及びグリシンが付加したCTに反応する抗体を用いて検討したところ,NIH3T3ではグリシン付加CT,CHOではアミド化CTが産生されていることが分かった。今後は培養細胞株のみならず,in vivoでの皮膚の初代培養細胞を用いてCT発現を検討する課題が残された。

Thyroid C cell precursor production, limited cut off, reverse transformation, physiologically active CT. The characteristics of endocrine cells are skin cells, muscle cells, and non-endocrine cells. The purpose of this study is to study the expression of CT gene in cells, and to evaluate the expression of CT gene. At the beginning of the year, the physiological activity of CT precursor cDNA was equal to that of DNA, and the physiological activity of CT precursor cDNA was 50 times stronger than that of DNA. In addition, CT precursors and endocrine cells are not restricted to the presence of the enzyme Furin, which is responsible for the cleavage of the enzyme Furin. 2 years to limit the rate of reverse transcription, CT and DNA alignment That is to say, the end of the game is not the same as the end of the game. In addition, the cleavage site of CT is-1 position,-4 position and basic cleavage site is-6 position, and the cleavage efficiency is upward. The C-terminal DNA of COS-7 was introduced into the normal CT system. It is necessary to change the physiological activity of CT. The cDNA sequence of this gene is called cDNA sequence. CT is the first cell to be developed. NIH 3 T3 is the first cell to be developed. NIH 3 T3 contains a large amount of Furin, a small amount of CHO Furin, a large amount of Furin, and a large amount of CHO Furin. In 2003, the first batch of CT precursors was collected and analyzed. In addition, NIH 3T3 has also developed anti-CT antibodies, and anti-CT antibodies have been used in the production of anti-CT antibodies. In the future, the development of CT in primary cultured skin cells in vivo will be discussed.