カルシトニン遺伝子を組み込んだ細胞医薬

整合降钙素基因的细胞药物

基本信息

批准号：
03557110
负责人：
竹内利行
金额：
$ 8.45万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

カルシトニン(CT)は甲状腺C細胞で前駆体として産生され,限定切断反応とアミド化反応をうけて生理活性型CTとなる。これらの反応は内分泌細胞に特徴的で,皮膚細胞,筋肉細胞,リンパ球のような非内分泌細胞ではおこらない。我々は生理活性型CTを適度に分泌する“細胞医薬"を非内分泌細胞を用いて作る目的で,CT遺伝子を上記のような細胞で発現させることを試みている。初年度は,ヒトCT前駆体cDNA中の生理活性CTに相等するDNA部分を,ヒトより50倍生理活性が強いサケCT DNAに置き換えた。次にCT前駆体が内分泌細胞のみならず非内分泌細胞にも広く存在する限定切断酵素Furinの切断反応をうけるように,サケCT部分の両端を4つの連続した塩基性アミノ酸配列をコードするDNAに変異させた。2年度は限定切断反応の効率を上げるため,CTのカルボキシル端(C)に伸びるペプチド部分をDNA配列から切除した。即ちC端はアミド化の基質であるグリシンになった。更にCTのアミノ酸の切断部位も-1位から-4位の塩基性アミノ酸に加えて-6位にアルギニン基を加え,切断効率の向上をはかった。この変異CT DNAを導入したCOS-7は正常CTと同じサイズでC端にグリシンが付加したカルシトニンを産生した。しかしCTが生理活性をもつためには更にグリシンがアミド化反応をうける必要がある。そこでアミド化酵素cDNAをラット脳cDNAライブラリーよりクローニングした。CTを発現させる細胞としてはNIH3T3とCHOを選んだ。NIH3T3は切断酵素Furinを多量に含むがアミド化酵素を含まず,逆にCHOはFurin活性は少ないが,アミド化酵素を多量に含むという特徴がある。3年度はこれらの細胞でCT前駆体がどのようなプロセシングを受けるかを検討した。産生されたCTを2年度に作成したアミド部分に反応する抗体,及びグリシンが付加したCTに反応する抗体を用いて検討したところ,NIH3T3ではグリシン付加CT,CHOではアミド化CTが産生されていることが分かった。今後は培養細胞株のみならず,in vivoでの皮膚の初代培養細胞を用いてCT発現を検討する課題が残された。

降钙素（CT）作为甲状腺C细胞的前体产生，并经历有限的裂解和胺化反应成为生理活性的CT。这些反应是内分泌细胞的特征，在非内分泌细胞（例如皮肤细胞，肌肉细胞和淋巴细胞）中不发生。我们正在尝试在上述细胞中表达CT基因，目的是创建使用非内分泌细胞中适度分泌生理活性CT的“细胞药物”。在第一年，与生理活性CT相当的人CT前体cDNA的DNA部分被鲑鱼CT DNA取代，鲑鱼CT DNA的生物活性是人类的50倍。接下来，将鲑鱼CT部分的两端突变为编码四个连续的碱性氨基酸序列的DNA，以便CT前体经历有限的乳化酶Furin的裂解反应，后者不仅在内分泌细胞中广泛存在，而且还广泛存在于非内分泌细胞中。在2017财年，为了提高有限的裂解反应的效率，从DNA序列中切除了延伸至CT羧基端（C）的肽部分。也就是说，C末端变成甘氨酸，是胺化的底物。此外，除了从位置-1到-4位的碱性氨基酸外，将精氨酸组添加到CT的裂解位点至-6位置以提高裂解效率。引入该突变体CT DNA的COS-7产生降钙素，甘氨酸添加到C端，其大小与正常CT相同。但是，为了使CT具有生理活性，甘氨酸有必要进行胺化反应。因此，将酰胺酶cDNA从大鼠脑cDNA文库中克隆。 NIH3T3和CHO被选为表达CT的细胞。 NIH3T3含有大量的裂解酶呋喃，但没有酰胺酶，并且CHO具有含有大量酰胺酶的特征，尽管它几乎没有呋喃活性。在2013财年，我们研究了CT前体如何在这些细胞中进行加工。当使用对2015年产生的酰胺部分反应的抗体研究产生的CT并与添加甘氨酸反应的抗体时，发现NIH3T3会产生甘氨酸添加的CT和CHO产生CT。将来，不仅在培养的细胞系中，而且在体内培养的皮肤细胞中研究CT表达仍然存在挑战。