枯草菌胞子形成期におけるDNA再編成

本研究では、SpoIIIDが組換え酵素の転写とDNA再編成に独立に関与していることを明らかとするために、spoIVCAとspoIIIDのプロモーターを枯草菌で誘導可能なプロモーターであるspacプロモーターの制御下に置き、栄養増殖期で同時に発現させた際のDNA再編成の有無を調べることを目的とした。spoIVCAを栄養増殖期に強制発現させ、DNA再編成の有無をみたところ、栄養増殖期ではDNA再編成は検出されず胞子形成期(T_3)に検出された。また、spoIIID変異株では、spoIVCAを強制発現させても胞子形成期にDNA再編成は検出されなかった。この結果から、SpoIIIDはDNA再編成に直接関与することが強く示唆された。spoIVCAとspoIIIDの同時発現系による証明は、現在おこなっている。次に、SpoIIIDが結合する遺伝子を探索をおこなった。SpoIIIDのC末端側に6個のヒスチジンが付加されたSpoIIID-hisをNi^<2+>-NTA(nitrilo-triacetic acid)アガロースに結合させ、枯草菌染色体DNAをを制限酵素により断片化し、このカラムに吸着させた。SpoIIID-hisに結合するDNA断片をイミダゾール濃度勾配により溶出し、このDNA断片を大腸菌のプラスミドベクターにクローン化し、その塩基配列を決定した。この結果、この中にはプリンおよびピリミジン合成系の遺伝子が存在し、これらの構造遺伝子内にSpoIIIDが結合することが明らかとなった。この結果から、SpoIIIDは、spoIVCAなどの胞子形成期に働く遺伝子を正または負に、また栄養増殖期に必要な遺伝子の発現を抑制している可能性が示唆された。

本研究では、SpoIIIDが組換え酵素の転写とDNA再編成に独立に関与していることを明らかとするために、spoIVCAとspoIIIDのプロモーターを枯草菌で誘導可能なプロモーターであるspacプロモーターの制御下に置き、栄養増殖期で同時に発現させた際のDNA再編成の有無を調べることを目的とした。spoIVCAを栄養増殖期に強制発現させ、DNA再編成の有無をみたところ、栄養増殖期ではDNA再編成は検出されず胞子形成期(T_3)に検出された。また、spoIIID変異株では、spoIVCAを強制発現させても胞子形成期にDNA再編成は検出されなかった。この結果から、SpoIIIDはDNA再編成に直接関与することが強く示唆された。spoIVCAとspoIIIDの同時発現系による証明は、現在おこなっている。次に、SpoIIIDが結合する遺伝子を探索をおこなった。SpoIIIDのC末端側に6個のヒスチジンが付加されたSpoIIID-hisをNi^<2+>-NTA(nitrilo-triacetic acid)アガロースに結合させ、枯草菌染色体DNAをを制限酵素により断片化し、このカラムに吸着させた。SpoIIID-hisに結合するDNA断片をイミダゾール濃度勾配により溶出し、このDNA断片を大腸菌のプラスミドベクターにクローン化し、その塩基配列を決定した。この結果、この中にはプリンおよびピリミジン合成系の遺伝子が存在し、これらの構造遺伝子内にSpoIIIDが結合することが明らかとなった。この結果から、SpoIIIDは、spoIVCAなどの胞子形成期に働く遺伝子を正または負に、また栄養増殖期に必要な遺伝子の発現を抑制している可能性が示唆された。