神経特異的カルモジュリン結合低分子量G蛋白Rinの新規シグナル伝達系の解析

神经元特异性钙调蛋白结合低分子量 G 蛋白 Rin 的新型信号转导系统分析

• 批准号: 10155208
• 负责人: 浦野 健
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10155208/
• 关键词: 低分子量G蛋白Rin; 神経特異的; カルモジュリン結合蛋白; リン酸化

低分子量G蛋白Rinは,神経系に特異的に発現するカルシウム依存性カルモジュリン結合蛋白として同定された。細胞の増殖,分化などを制御する低分子量G蛋白Rasと比較すると,いくつかの特徴的構造を有しており,神経系においてRas蛋白とは異なるRin蛋白に特有な新しい細胞内シグナル伝達系の存在が想定される。そこでRin蛋白の生理的役割を解析した。1) Rin蛋白とカルモジュリンの結合:細胞内においてRin蛋白とカルモジュリンはカルシウム依存性に結合することを確認した。さらに,酵母two-hybrid法を用いてin vivoにおけるRin蛋白とカルモジュリンの結合も証明した。2) Rin蛋白の細胞内局在:Rin cDNAをCOS細胞内へ導入し,細胞を超遠心法にて分画後ウエスタン法にてその局在を検討したところ,細胞膜分画にも発現を認めた。Rin蛋白は,細胞膜への結合に必要だと考えられているプレニレーション修飾部位をC末端に有しないにもかかわらず,細胞膜に存在することが判明した。3) Rin蛋白とMAPキナーゼ系との関係:活性型RinをCOS細胞内に導入しMAPキナーゼ系の活性化の有無を調べたところ,その活性化は認められなかった。また,Rasの標的蛋白の一つであるc-Rafとの結合も認められなかった。4) Rin蛋白に対するモノクローナル抗体の作製:大腸菌に発現させたRin蛋白を用いて、特異的モノクローナル抗体を作製した。この抗体は,ヒト特異的で,ウエスタン法および免疫沈降法に使用可能である。また,ウサギを免疫して,ポリクロナール抗体も得た。5) Rin蛋白のリン酸化:正リン酸を用いた実験で,COS細胞においてRin蛋白は10番目および200番目のセリン残基がリン酸化を受けることを証明した。さらに,これらのリン酸化は脳lysateによってもおこることが判明した。

低分子量G蛋白RIN被鉴定为在神经系统中特异性表达的钙依赖性钙调蛋白结合蛋白。与控制细胞增殖和分化的低分子量G蛋白Ras相比，它具有多种独特的结构，并且假定RIN蛋白独有的细胞内信号传导系统与神经系统中的Ras蛋白不同。因此，分析了RIN蛋白的生理作用。 1）RIN蛋白和钙调蛋白的结合：已证实RIN蛋白和钙调蛋白在细胞中以钙依赖性方式结合。此外，还使用酵母两杂化方法证明了RIN蛋白和钙调蛋白在体内的结合。 2）RIN蛋白的细胞内定位：RIN cDNA被引入COS细胞中，并通过超速离心分离细胞，然后通过西方方法检查定位，并在细胞膜馏分中观察到表达。尽管在C末端没有预苯式修饰位点，但发现RIN蛋白仍然存在于细胞膜中，这对于与细胞膜结合是必不可少的。 3）RIN蛋白与MAP激酶系统之间的关系：当将活性RIN引入COS细胞中时，检查了MAP激酶系统的存在或不存在激活时，未观察到激活。此外，观察到与RA的靶蛋白之一的C与C-RAF没有结合。 4）针对RIN蛋白的单克隆抗体制备：使用大肠杆菌中表达的RIN蛋白制备了特定的单克隆抗体。该抗体是人类特异性的，可用于西方和免疫沉淀方法。此外，对兔子进行免疫以获得多克隆抗体。 5）RIN蛋白的磷酸化：在使用正磷酸盐的实验中，我们证明了RIN蛋白在COS细胞中的第10和200丝氨酸残基发生磷酸化。此外，发现这些磷酸化也是由脑裂解物发生的。

项目成果

Sterpetti,P.: "Activation of the Lbc Rho exchange factor proto-oncogene by truncation of an extended C terminus that regulates transformation and targeting." Mol.Cell.Biol.19・2. 1344-1345 (1999)

Sterpetti, P.：“通过截短调节转化和靶向的延伸 C 末端来激活 Lbc Rho 交换因子原癌基因。”Mol.Cell.Biol.19·2（1999）。