メダカ初期胚を用いた血栓止血因子の血管形成・新生における役割の解明

使用早期青鳉胚胎阐明血栓止血因子在血管生成和新生中的作用

• 批准号: 11877027
• 负责人: 鈴木 宏治
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Mie University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11877027/
• 关键词: 血管新生; 血管形成; 硬骨魚類; メダカ胚; 血栓止血因子; 遺伝子導入; 遺伝子ノックアウト; 遺伝子クローニング; メダカ; 血液凝固因子; 組織因子; cDNAクローニング; 血栓形成

血管の形成と新生には多くの細胞増殖促進因子や抑制因子、細胞遊走因子、細胞接着因子、プロテアーゼとインヒビターなどの関与が示唆されている。最近の種々の遺伝子ノックアウト(KO)マウスの解析から、血管の形成に血栓止血関連因子が極めて重要なことが明らかになってきた。しかし、これらのKOマウスの多くは胎生期に死亡するため、詳細な解析が困難である。他方、最近、メダカなどの硬骨魚類は哺乳動物と多くの共通点を有し、組織の構造も単純で胚形成に関与する細胞も少なく、かつ体外発生で発生過程を容易に継続的に観察できることから、マウスに変わる実験動物として注目されている。この背景の下、本研究では遺伝子トランスジェニック(TG)魚や遺伝子KO魚を作製し、血管形成や血管新生における血栓止血因子の役割を解析することを目的とした。本年度は、昨年に続きメダカの組織因子(TF)のcDNAクローニングを試みた。先ず、ヒト組織因子cDNAをプローブとして、メダカの全身由来のmRNAのノザンブロット解析を行ったところ、特異的なmRNAは検出できなかった。次に、種間でその配列が比較的よく保存されている部分に種々のプライマー対を作製し、メダカの全身のmRNAに対するcDNAを鋳型としてPCR法を用いて増幅を試みたが、特異的な増幅DNA断片は得られなかった。そこで、さらにメダカ遺伝子DNAを鋳型として、同様のプライマーを用いて増幅を試みたところ、約120塩基対からなるメダカTFをコードするDNA断片が増幅された。このメダカTF cDNAは、マウスTFとDNAレベルでは92.2%、アミノ酸レベルで87.2%の相同性を示した。現在、5'RACE法および3'RACE法を用いて、完全長メダカTF cDNAの単離を行うとともに、トロンボモジュリンやプロテインCなどの抗血栓性因子のcDNAクローニングを実施している。

Vascular の form と freshman に は more く の cells raised colonization promote factor や inhibiting factor, cell factor, cell factor, then プ ロ テ ア ー ゼ と イ ン ヒ ビ タ ー な ど の masato and が in stopping さ れ て い る. Son recently の kind of 々 の heritage 伝 ノ ッ ク ア ウ ト (KO) マ ウ ス の parsing か ら, blood vessels, の に thrombosis hemostatic masato even factor が め extremely important な て こ と が Ming ら か に な っ て き た. <s:1> な な, が れら, <s:1> KO, ウス, ウス, multiple く, く, に, fetal death するため, detailed な analysis が, difficult である. Fang, recently, メ ダ カ な ど の bony fishes は mammals と more く の in common の を し, organization structure も 単 pure で embryogenesis に masato and す る cells less も な く, か つ born in vitro 発 で 発 を birth process easy に 継 続 of に 観 examine で き る こ と か ら, マ ウ ス に - わ る be 験 animal と し て attention さ れ て い る. の こ の background, this study で は posthumous son 伝 ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク (TG) fish や heritage 伝 し, KO fish を son や angiogenesis angiogenesis に お け る thrombus hemostatic factors analytical す cut を の service る こ と を purpose と し た. This year ロ, last year に続 に続 メダカ メダカ <s:1> <s:1> <s:1> <s:1> <s:1> of the <s:1> tissue factor (TF) <s:1> cDNA ロ ロ ニ グを グを グを みた test みた. First ず, ヒ ト tissue factor cDNA を プ ロ ー ブ と し て, メ ダ カ の body origin の mRNA の ノ ザ ン ブ ロ ッ ト parsing line を っ た と こ ろ, specific な mRNA は 検 out で き な か っ た. に, interspecific で そ の match column が comparison よ く save さ れ て い る part に kind 々 の プ ラ イ マ ー を for seaborne し, メ ダ カ の systemic の mRNA に す seaborne る cDNA を type where と し を て PCR method with い て rights of を try み た が な raised of, specific DNA fragment は have ら れ な か っ た. そ こ で, さ ら に メ ダ カ posthumous son 伝 DNA を type where と し て, with others in の プ ラ イ マ ー を with い て rights of を try み た と こ ろ, about 120 salt base ain か ら な る メ ダ カ TF を コ ー ド す る DNA fragment が rights of さ れ た. こ の メ ダ カ TF cDNA は, マ ウ ス TF と DNA レ ベ ル で は 92.2%, ア ミ ノ acid レ ベ ル で 87.2% gay を の phase in し た. Now, the 5 'RACE method お よ び 3' RACE method を with い て, long completely メ ダ カ TF cDNA の 単 line from を う と と も に, ト ロ ン ボ モ ジ ュ リ ン や プ ロ テ イ ン C な ど の thrombus resistance factor の cDNA ク ロ ー ニ ン グ を be applied し て い る.

项目成果

Yuasa,H.: "Bovine protein C inhibitor has a unique reactive site and can transiently inhibit plasmin"Thromb.Haemost.. 83. 262-267 (1999)

Yuasa,H.：“牛蛋白 C 抑制剂具有独特的反应位点，可以暂时抑制纤溶酶”Thromb.Haemost.. 83. 262-267 (1999)

Tsuneyoshi,N.: "Expression and anticoagulant function of the endothelial cell protein C receptor (EPCR) in cancer cell lines."Thromb.Haemost.. 85. 356-361 (2001)

Tsuneyoshi,N.：“癌细胞系中内皮细胞蛋白 C 受体 (EPCR) 的表达和抗凝功能。”Thromb.Haemost.. 85. 356-361 (2001)

Oka,S.: "Role of activated protein C in helicobacter pylori-associated gastritis."Infect.Immunity.. 68. 2863-2869 (2000)

Oka,S.：“活化蛋白 C 在幽门螺杆菌相关性胃炎中的作用。”Infect.Immunity.. 68. 2863-2869 (2000)

Ido,M.: "Identification of a novel 33-kDa Ser/Thr kinase that phosphorylates the cytoplasmic tail of protease-activated redceptor 1(thrombin receptor) in human platelets."Thromb.Haemost.. 83. 617-621 (2000)

Ido,M.：“鉴定一种新型 33-kDa Ser/Thr 激酶，该激酶可磷酸化人血小板中蛋白酶激活的红受体 1（凝血酶受体）的胞质尾部。”Thromb.Haemost.. 83. 617-621 (2000)

Suzuki,K.: "Pulmonary Embolism"Springer. 195 (1999)

铃木，K.：“肺栓塞”施普林格。