細菌人工染色体による相同組換え

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ES細胞における相同組換え頻度を左右する要因はよく分かっていない。唯一確からしいのは、相同部分の長さであり、長いほど頻度は上昇すると考えられている。しかし、通常のプラスミドでは、挿入できる長さに限界があり、約2-3kdの相同部分しか含ませることはできない。しかし、細菌人工染色体を用いれば、200kbと約100倍の相同部分を含ませることが可能である。この細菌人工染色体を用いて、ES細胞における相同組換えの頻度を上昇させることができるかどうかを検討した。実験系として、ミエリン形成不全に基づく振戦を呈するqkマウスの原因遺伝子であるqkl遺伝子を用いた。qk遺伝子からは大きく分けると5kb、6kb、7kbの3種類のRNAが、alternative splicingによって産生され、その違いは第6エクソンにある。しかし、それぞれのRNAの発現の組織特異性や時期特異性は若干異なるが、調節機構は不明である。また役割も不明である。そこでそれぞれのRNAに特異的な第6エクソンを破壊するようデザインした細菌人工染色体を構築し、これらを用いて相同組換えを行ない、通常のプラスミドベクターでの頻度と比較することを試みた。このためには、大腸菌の中で、人工染色体に含まれるqkl遺伝子にネオ耐性遺伝子等を相同組換えにより導入しなければならない。そのための系としてrecA、qkl、ネオ耐性遺伝子を含むシャトルベクターを作製し、それを人工染色体に導入しようとしたが、不成功に終わった。大腸菌内での相同組換えのためには熟練を要することが分かった。