染色体DNAのメチル化状態を規定する因子の機能領域構造の解析

脊椎動物の染色体DNAではCpG配列中のシトシンはしばしばメチル化修飾を受けており、発生段階・組織に特徴的なメチル化模様を示す。DNAのメチル化は、組織特異的な遺伝子の発現、遺伝子刷込、X染色体の不活性化、胚発生などの現象に深く関わっている。本研究ではDNAメチル化状態規定因子を発現・精製し、その機能領域構造を明らかにすることを目指している。1.Dnmt1の領域構造Dnmt1(分子量180k)のN末の36kDaの領域はex1からex11にコードされることを明らかにした。組換型N末領域はDnmt1全長と同等のPCNA結合能力があること、しかし報告のようにDNA結合能力ほ無いことが判った。酵母two-hybrid法で同定した新規因子F1はこの36kDa領域と相互作用することを明らかにした。2.Dnmt3a、Dnmt3bの発現・精製とその性質精製した組換型Dnmt3aとDnmt3b酵素学的な性質を解析し、何れもde novo型のDNAメチル化活性を示すことを明らかにした。また、Dnmt3bはCpG配列中のC以外にもCpTとCpA配列のCをもメチル化することがわかった。3.MBD4の機能領域MBD4は分子内にメチル化DNA結合領域をもつ、T : Gミスマッチ認識グリコシラーゼであるが、脳組織に一部欠失した特異的なスプライシング・アイソフォームを見出した。この欠失領域はグリコシラーゼ触媒領域のすぐ上流に位置し、種間で良く保存されていた。この分子と全長の組換体を精製して活性を調べたがグリコシラーゼ活性に差はみとめられなかった。

脊椎動物の染色体DNAではCpG配列中のシトシンはしばしばメチル化修飾を受けており、発生段階・組織に特徴的なメチル化模様を示す。DNAのメチル化は、組織特異的な遺伝子の発現、遺伝子刷込、X染色体の不活性化、胚発生などの現象に深く関わっている。本研究ではDNAメチル化状態規定因子を発現・精製し、その機能領域構造を明らかにすることを目指している。1.Dnmt1の領域構造Dnmt1(分子量180k)のN末の36kDaの領域はex1からex11にコードされることを明らかにした。組換型N末領域はDnmt1全長と同等のPCNA結合能力があること、しかし報告のようにDNA結合能力ほ無いことが判った。酵母two-hybrid法で同定した新規因子F1はこの36kDa領域と相互作用することを明らかにした。2.Dnmt3a、Dnmt3bの発現・精製とその性質精製した組換型Dnmt3aとDnmt3b酵素学的な性質を解析し、何れもde novo型のDNAメチル化活性を示すことを明らかにした。また、Dnmt3bはCpG配列中のC以外にもCpTとCpA配列のCをもメチル化することがわかった。3.MBD4の機能領域MBD4は分子内にメチル化DNA結合領域をもつ、T : Gミスマッチ認識グリコシラーゼであるが、脳組織に一部欠失した特異的なスプライシング・アイソフォームを見出した。この欠失領域はグリコシラーゼ触媒領域のすぐ上流に位置し、種間で良く保存されていた。この分子と全長の組換体を精製して活性を調べたがグリコシラーゼ活性に差はみとめられなかった。