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フローサイトメトリーを用いた肝臓における幹細胞の特性解析

使用流式细胞术表征肝脏中的干细胞

基本信息

批准号：
03F03140
负责人：
谷口英樹
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F03140/
关键词：
hepatic stem cells flow cytometry AAF hepatectomy Fischer rat c-Met

项目摘要

本研究は、慢性肝炎や糖尿病など群・膵疾患に対する再生医療の実現を目標として、組織幹細胞を安全かつ簡便に分離・操作する新技術を確立するとともに、幹細胞の分化・増殖機構の分子基盤を解明し、人為的な再生制御を可能とする手法の開発を試みるものである。すなわち、単離した肝細胞集団の中から、極少数しか存在しない組織幹細胞を、FACS(fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた精度の高い細胞分離法により純化・回収し、幹細胞のより高度な操作技術(自己複製による培養系における増幅、可塑性の制御等)の確立や幹細胞の分化・増殖機構の解明を行った。まず、本研究室における先行研究で明らかとなっているマウス胎児肝臓中の肝幹細胞に関する知見を基盤として、ラット胎児肝臓における肝幹細胞の分離を試みた。その結果、ラット胎児肝臓における非血球画分中のICAM-1^+RT1A^<low/->細胞に、高い増殖能・多分化能・組織再構築能を兼ね備えた肝幹細胞が限定的かつ高頻度に存在することが判明した。そこで、幹細胞が活性化されていると考えられる肝障害成体ラットの肝臓を対象として、同様の細胞が存在するのか否かを解析した。すなわち、AAF(acetylaminofluorene)投与と肝切除を行った肝障害ラットモデルの成体肝臓を解析したところ、ラット胎児肝臓と同様にICAM-1^+RT1A^<low/->細胞が存在することが判明した。このICAM-1^+RT1A^<low/->細胞の80%以上が、マウス胎児肝臓中の肝幹細胞のマーカーであるc-Metを発現していた。また、FACSで分離したICAM-1^+RT1A^<low/->細胞を対象としたRT-PCRによる解析結果より、この細胞画分にAFP, c-Met、c-Kit, albuminなど肝前駆細胞で発現している複数の遺伝子が強く発現していることが確認された。培養実験の結果より、ICAM-1^+RT1A^<low/->細胞は他の画分と比較してより高い増殖能を持っており、移植実験でもin vivoにおける組織再構築能も高いことが明らかになった。以上の結果より、成体肝臓と胎仔肝臓における幹細胞細胞表面マーカーの表現型には関連性があることが示唆され、FACSを用いて成体肝幹細胞の分離と同定も可能であると考えられた。

This study aims to develop regenerative medicine for chronic hepatitis and diabetes mellitus, establish new techniques for the safe and simple isolation and manipulation of stem cells, clarify the molecular basis for stem cell differentiation and proliferation, and develop methods for the prevention of artificial regeneration. The high precision cell separation method for the purification, recovery, and operation of stem cells (amplification of culture lines for self-replication, control of plasticity, etc.) and the establishment of differentiation and propagation mechanisms of stem cells are well understood. In our laboratory, we have conducted a pilot study on the isolation of hepatic stem cells from fetal liver. The results showed that ICAM-1 ^+ RT1A ^<low/-> cells, high proliferation, pluridifferentiation and tissue remodeling in fetal liver stem cells were present at high frequency. This is the first time that stem cells have been activated. The presence of ICAM-1 ^+ RT1A ^<low/-> cells in adult liver tissue after hepatectomy was identified. More than 80% of ICAM-1 ^+ RT1A ^<low/-> cells were found in fetal liver. FACS isolation of ICAM-1 ^+ RT1A ^<low/-> cell targets and RT-PCR analysis results confirmed that AFP, c-Met, c-Kit, albumin, and multiple proteins were strongly detected in liver cells. Culture results: ICAM-1 ^+ RT1A ^<low/-> cell culture results: cell culture results: cell The above results show that the phenotype of adult liver stem cells is related to that of fetal liver cells.