ゲノム情報にもとづいた新規立体構造をもつ制限酵素の探索と機能解析

基于基因组信息的新型三维结构限制性内切酶的搜寻及功能分析

• 批准号: 07F07420
• 负责人: 小林 一三
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07F07420/
• 关键词: DNAタンパク質相互作用; タンパク質立体構造; 制限酵素; 無細胞タンパク質合成; 構造生物学; バイオインフォマティクス; DNAメチル化; DNA切断

制限酵素は分子生物学研究で使われるなかで最も重要な種類の酵素であり、DNAを望む位置で切断するのに使われる。制限酵素と対になっているメチル化酵素は、ホストDNAをメチル化して切断から守り、細胞が死ぬのを防ぐ。当研究室での原核生物ゲノムの系統的な解析から、新しい構造と性質を示す制限酵素候補の存在が示唆された。そのような新しい制限酵素を探すために、私は生化学的実験を行った。実験のデザインは、標的の大腸菌にクローン化し、小麦胚芽由来無細胞発現系を使って発現し、DNA分解活性を調べるというものである。私は、新しいフォールド(基本立体構造)を取る可能性のある12の候補をスクリーンし、2つに制限酵素活性を発見した。それらの認識配列を決定した。これらは、配列のホモロジー検索と立体構造予測から、新しいフォールドを取る可能性が高い。さらに、適切なベクターを選ぶ事によって、そのうち一つのin vivoでの発現に成功した。His-tagを付けての発現によって、3つのカラムを使って、95%以上の純度に精製することができた。タグを取り除き、二つのアミノ酸残基をN端に持つタンパク質を得た。その切断反応の条件を至適化した。認識配列を二つもつDNAを好んで切断するタイプかを検討中である。第2の研究対象は、上のようなデザインで既に当研究室で発見されたPabI制限酵素の解析である。これは、ハーフパイプと呼ばれる溝を持っている。DNAがそこを滑っていき反応がプロセッシブに成る可能性を、様々なDNAを用いて検討している。

Restriction enzymes are the most important types of enzymes in molecular biology research, and DNA is the most important type of enzymes that can cut them at their location. Restriction enzyme と対になっているメチル化zyme は, ホストDNA をメチル化して cut off からkeeper り, cell death ぬのを Prevention ぐ. When the laboratory analyzes the prokaryotic biomass system, the new structures and properties are revealed, and the existence of restriction enzyme candidates is revealed.そのような新しいRestricted Enzyme をExploration すために, Private Biochemistry 実験を行った.実験のデザインは, the target coliform bacteria, and wheat germ origin are unknown. Cytokinesis is caused by って発appearing, and DNA decomposition activity is adjusted by べるというものである. Private は, new しいフォールド (basic three-dimensional structure) をtake る possibility のある12 の candidate をスクリーンし, 2 つに limit enzyme activity を発见した.それらのKnowing and matching arrangement をDecision した.これらは, arrangement of のホモロジー検素とthree-dimensional structure prediction から, new しいフォールドをtake るhigh possibility.さらに、suitable なベクターを选ぶ事によって、そのうち一つのin vivoでの発成に成した. His-tag けての発成によって, 3つのカラムを使って, 95% or more purity にRefined することができた. The タグをtakes and removes the つのアミノ acid residue and the N-terminal にhold つタンパクquality をgets た. The conditions for cutting off the reaction are optimized. Recognize the arrangement of を二つもつDNAを好んでcutするタイプかを検同中である. The 2nd research project is based on the analysis of PabI restriction enzyme in the laboratory.これは、ハーフパイプとHUばれるgulch をhold っている. DNA がそこを slippery っていきがプロセッシブに成る possibility を, 様々なDNA を用いて検 Discussion している.