ゲノムに存在するDNA:RNAハイブリッドの探索と機能解析

基因组中 DNA:RNA 杂交体的搜索和功能分析

• 批准号: 21657001
• 负责人: 村上 洋太
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21657001/
• 关键词: DNA:RNAハイブリッド; 分裂酵母; クロマチン

分裂酵母のRNAi依存性ヘテロクロマチン形成ではヘテロクロマチン内で転写されるnon-coding RNAがRNAiの契機となる。このnon-coding RNAヒストンを標的とするRNA免疫沈降法(ヒストンRIP法)によりこのnon-coding RNAが、DNA:RNAハイブリッドを形成することが予想された。この方法は途中RNase H処理によりハイブリッドの存在を確認するなど間接的なため、in vivoで実際にハイブリッドが存在することを、ハイブリッドに特異的なモノクローナル抗体を入手し免疫蛍光染色法により検討をおこない、in vivoで実際にハイブリッドが存在することを確認したが、さらに詳細な解析によりユークロマチン領域にもハイブリッドが形成される証拠を得た。この結果からヘテロクロマチンにかぎらずゲノムワイドにDNA:RNAハイブリッドのマッピングをおこなうことを考えた。免疫染色による検出は簡便ではあるが、ゲノム上でのハイブリッド形成の場所を特定するには不利である。またヒストンRIP法は操作が煩雑であるため、より広範かつ詳細な解析のためには、ハイブリッド検出の新規手法が必要と感じ、上記モノクローナル抗体によってハイブリッドを直接免疫沈降する方法を試みたが、抗体が免疫沈降に適さず機能しないことが判明した。そこでヒストンRIP法の改善を試み、クロマチンとともに沈降するDNAのうちハイブリッド形成しているものを抽出することに成功した。

Split yeast の RNAi dependency ヘ テ ロ ク ロ マ チ ン form で は ヘ テ ロ ク ロ マ チ ン で within planning write さ れ る non - coding RNA が RNAi の opportunity と な る. こ の non - coding RNA ヒ ス ト ン を mark と す る RNA immune sink method (ヒ ス ト ン RIP) に よ り こ の が non - coding RNA, DNA, RNA ハ イ ブ リ ッ ド を form す る こ と が to think さ れ た. こ の way は way RNase H 処 Richard に よ り ハ イ ブ リ ッ ド の exist を confirm す る な ど indirect な た め, the in vivo で be interstate に ハ イ ブ リ ッ ド が exist す る こ と を, ハ イ ブ リ ッ ド に specific な モ ノ ク ロ ー ナ を ル antibody of し immune 蛍 light staining に よ り beg を 検 お こ な い, in Vivo で be interstate に ハ イ ブ リ ッ ド が exist す る こ と を confirm し た が, さ ら に detailed analytical に な よ り ユ ー ク ロ マ チ ン field に も ハ イ ブ リ ッ ド が form さ れ る card 拠 を た. こ の results か ら ヘ テ ロ ク ロ マ チ ン に か ぎ ら ず ゲ ノ ム ワ イ ド に DNA, RNA ハ イ ブ リ ッ ド の マ ッ ピ ン グ を お こ な う こ と を exam え た. Immune dyeing に よ る 検 out simple は で は あ る が, ゲ ノ ム on で の ハ イ ブ リ ッ ド を form の places particular す る に は adverse で あ る. ま た ヒ ス ト ン RIP は が operation bother 雑 で あ る た め, よ り hiroo van か つ detailed analytical の な た め に は, ハ イ ブ リ ッ ド 検 out の new rules が と feeling じ necessary, written モ ノ ク ロ ー ナ ル antibody に よ っ て ハ イ ブ リ ッ ド を direct immune sink す る method を try み た が が, antibody immune sink に optimum さ ず function し な い こ と が.at し た . の そ こ で ヒ ス ト ン RIP method improve を み, ク ロ マ チ ン と と も に sink す る DNA の う ち ハ イ ブ リ ッ ド form し て い る も の を spare す る こ と に successful し た.

项目成果

Non-coding RNA binds to heterochromatin via DNA : RNA hybrid to mediate RNAi-directed heterochromatin formation

非编码 RNA 通过 DNA 与异染色质结合：RNA 杂交体介导 RNAi 指导的异染色质形成

• 发表时间: 2011
• 作者: 村上洋太;高畑信也;梶谷卓也;鈴木詔大;千田香織;森美由紀
• 通讯作者: 森美由紀

Dynamic Regulation of heterochromatin sturucture/function in the cell cycle.

细胞周期中异染色质结构/功能的动态调节。

• 发表时间: 2009
• 作者: Valencia-Burton;M.;Oki;M.;Johnson;J.;Seier;TA.;Kamakaka;R.;Haber;JE.;Hiromitsu Yamamoto;Maria Valencia-Burton;Akiko Tsumura;Tetsushi lida;Alexandra M Locovei;Maria A.Marchetti;Hiroaki Kato;Hidetsugu Kohzaki;沖昌也;沖昌也;中山潤一;中山潤一;沖昌也;沖昌也;中山潤一;村上洋太;中山潤一;中山潤一;中山潤一;沖昌也;沖昌也;沖昌也;沖 昌也;中山潤一;沖昌也;中山 潤一;村上洋太
• 通讯作者: 村上洋太

Dynamic Regulation of Heterochrimatin

异染色质的动态调控

• 发表时间: 2009
• 作者: Valencia-Burton;M.;Oki;M.;Johnson;J.;Seier;TA.;Kamakaka;R.;Haber;JE.;Hiromitsu Yamamoto;Maria Valencia-Burton;Akiko Tsumura;Tetsushi lida;Alexandra M Locovei;Maria A.Marchetti;Hiroaki Kato;Hidetsugu Kohzaki;沖昌也;沖昌也;中山潤一;中山潤一;沖昌也;沖昌也;中山潤一;村上洋太;中山潤一;中山潤一;中山潤一;沖昌也;沖昌也;沖昌也;沖 昌也;中山潤一;沖昌也;中山 潤一;村上洋太;村上洋太;村上洋太
• 通讯作者: 村上洋太

RNAi依存性ヘテロクロマチンにおけるnon-coding RNAの動態と機能制御

RNAi依赖性异染色质中非编码RNA的动力学和功能调控

• 发表时间: 2010
• 作者: 山下康貴;松村幸彦;吉田拓也;村上洋太
• 通讯作者: 村上洋太

Dynamic regulation of heterochromatin via phosphorylation of HP1-family proteins.

通过 HP1 家族蛋白的磷酸化动态调节异染色质。

• 发表时间: 2010
• 期刊: Epigenetics 5
• 作者: Shimada;A.;Murakami;Y.
• 通讯作者: Y.