ゲノムに存在するDNA:RNAハイブリッドの探索と機能解析

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分裂酵母のRNAi依存性ヘテロクロマチン形成ではヘテロクロマチン内で転写されるnon-coding RNAがRNAiの契機となる。このnon-coding RNAヒストンを標的とするRNA免疫沈降法(ヒストンRIP法)によりこのnon-coding RNAが、DNA:RNAハイブリッドを形成することが予想された。この方法は途中RNase H処理によりハイブリッドの存在を確認するなど間接的なため、in vivoで実際にハイブリッドが存在することを、ハイブリッドに特異的なモノクローナル抗体を入手し免疫蛍光染色法により検討をおこない、in vivoで実際にハイブリッドが存在することを確認したが、さらに詳細な解析によりユークロマチン領域にもハイブリッドが形成される証拠を得た。この結果からヘテロクロマチンにかぎらずゲノムワイドにDNA:RNAハイブリッドのマッピングをおこなうことを考えた。免疫染色による検出は簡便ではあるが、ゲノム上でのハイブリッド形成の場所を特定するには不利である。またヒストンRIP法は操作が煩雑であるため、より広範かつ詳細な解析のためには、ハイブリッド検出の新規手法が必要と感じ、上記モノクローナル抗体によってハイブリッドを直接免疫沈降する方法を試みたが、抗体が免疫沈降に適さず機能しないことが判明した。そこでヒストンRIP法の改善を試み、クロマチンとともに沈降するDNAのうちハイブリッド形成しているものを抽出することに成功した。