分裂酵母をを用いた試験管内複製系の構築

分裂酵母の抽出液を用いた試験管内複製系の構築を目指している。ます、faithfulな複製のためには鋳型DNAがクロマチン構造を取ることが重要と考え、第一段階として試験管内でプラスミドDNAを用いたクロマチン再構成系の構築を試みた。すでに出芽酵母で試験家内クロマチン再構成系の報告があるのでこれを元に分裂酵母の系の構築を行った。その結果効率は低いものの再構成系の構築ができた。そこで、分裂酵母複製開始点を含むプラスミドDNAを用い、クロマチンの再構成を行った後に基質を加え、DNA複製反応を行わせることを試みた。基質の鋳型DNAへの取りこみは観察できたが、複製開始点への依存性はなく非特異的に反応が起こっていた。詳細な解析の結果、この取り込みは鋳型DNAに元から存在するnickに依存する修復反応であることがわかった。つまり、ここで得た抽出液は強い修復活性を持っていることになり、当初の目的とは異なるが、修復反応の解析にこの系を使うことは可能であろう。次の段階として、再構成したクロマチンを単離しこれを鋳型として複製を行わせる系の構築を試みる必要があると考えた。まず、容易にクロマチンDNAを単離するために鋳型DNAにlacl蛋白質の結合配列を挿入し、あらかじめ精製したlacl-GST融合タンパク質を結合させておき、クロマチン形成反応ののち、グルタチオンカラムを用いて融合タンパク質と結合したDNAを効率よく回収することを試みた。予備的な結果ではかなり効率よく回収できることを確かめている。

分裂酵母の抽出液を用いた試験管内複製系の構築を目指している。ます、faithfulな複製のためには鋳型DNAがクロマチン構造を取ることが重要と考え、第一段階として試験管内でプラスミドDNAを用いたクロマチン再構成系の構築を試みた。すでに出芽酵母で試験家内クロマチン再構成系の報告があるのでこれを元に分裂酵母の系の構築を行った。その結果効率は低いものの再構成系の構築ができた。そこで、分裂酵母複製開始点を含むプラスミドDNAを用い、クロマチンの再構成を行った後に基質を加え、DNA複製反応を行わせることを試みた。基質の鋳型DNAへの取りこみは観察できたが、複製開始点への依存性はなく非特異的に反応が起こっていた。詳細な解析の結果、この取り込みは鋳型DNAに元から存在するnickに依存する修復反応であることがわかった。つまり、ここで得た抽出液は強い修復活性を持っていることになり、当初の目的とは異なるが、修復反応の解析にこの系を使うことは可能であろう。次の段階として、再構成したクロマチンを単離しこれを鋳型として複製を行わせる系の構築を試みる必要があると考えた。まず、容易にクロマチンDNAを単離するために鋳型DNAにlacl蛋白質の結合配列を挿入し、あらかじめ精製したlacl-GST融合タンパク質を結合させておき、クロマチン形成反応ののち、グルタチオンカラムを用いて融合タンパク質と結合したDNAを効率よく回収することを試みた。予備的な結果ではかなり効率よく回収できることを確かめている。