自然免疫に重要なcGASを活性化するZCCHC3の作用機構の解明

阐明 ZCCHC3 激活 cGAS 的作用机制，这对先天免疫很重要

基本信息

批准号：
22K06546
负责人：
水口峰之
金额：
$ 2.66万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

ヒトZCCHC3の大腸菌による大量発現系の構築を行った。全長ZCCHC3（1-403残基）のアミノ酸配列をコードするDNAを大腸菌用の発現ベクターに導入した。ZCCHC3は可溶化タグのLipoyl domainとの融合タンパク質として発現した。Lipoyl domainのN末端には精製用のHis-tagを付加した。Ni-NTA樹脂を用いてLipoyl domainとZCCHC3の融合タンパク質を精製し、その後TEVプロテアーゼでLipoyl domainとZCCHC3を切り離した。Lipoyl domainをNi-NTA樹脂で除去した後、ゲルろ過クロマトグラフィーでZCCHC3を精製した。LB培地800 mLの大腸菌培養液から、高純度のZCCHC3を十分量得ることに成功した。さらに、ZCCHC3の天然変性領域（1-160残基）の発現・精製にも取り組んだ。ZCCHC3の1-160残基のN末端にHis-tagを付加して大腸菌で発現し、Ni-NTA樹脂で精製したところ高純度のZCCHC3(1-160)を得ることができた。次に、ZCCHC3とDNAの相互作用をゲルシフトアッセイで調べた。その結果、天然変性領域の1-160残基フラグメントよりも全長ZCCHC3のほうがDNAに強く結合することがわかった。この実験では枯草菌由来の50 bpの二本鎖DNAを用いた。この枯草菌由来DNAは、自然免疫における重要なDNAセンサーであるcGASと複合体を形成し、cGASを活性化すると報告されている。また、cGASでもゲルシフトアッセイを行ったところ、枯草菌由来の二本鎖DNAに対する結合親和性は、ZCCHC3よりもcGASのほうが強いことが示された。さらに、ZCCHC3はHIV-1由来逆転写産物の一本鎖DNAのSL2領域と結合するが、SL2に対するZCCHC3の結合親和性は低いことがわかった。

使用大肠杆菌构建了人类ZCCHC3的大规模表达系统。将全长ZCCHC3（残基1-403）的氨基酸序列编码的DNA引入了大肠杆菌的表达载体中。 ZCCHC3表示为融合标签Lipoyl结构域的融合蛋白。纯化HIS标签被添加到Lipoyl域的N末端。使用Ni-NTA树脂纯化了Lipoyl结构域和ZCCHC3的融合蛋白，然后通过TEV蛋白酶分离Lipoyl域和ZCCHC3。用Ni-NTA树脂去除Lipoyl结构域后，通过凝胶过滤色谱法纯化ZCCHC3。我们成功地从800 mL LB培养基获得了足够数量的高纯度ZCCHC3。此外，我们还研究了ZCCHC3天然修饰区（残基1-160）的表达和纯化。通过将His标签添加到ZCCHC3 1-160的N末端，并使用Ni-NTA树脂纯化以获得高纯度ZCCHC3（1-160），将混合物表达在大肠杆菌中。然后通过凝胶移位测定检查ZCCHC3和DNA之间的相互作用。结果表明，全长ZCCHC3比自然修饰区的1-160残基片段更与DNA结合。在该实验中，使用了枯草芽孢杆菌的50 bp双链DNA。据报道，这种枯草芽孢杆菌衍生的DNA与CGA形成了复合物，CGA是先天免疫中重要的DNA传感器，并激活CGA。此外，对CGA进行了凝胶移位测定，并且表明CGA对衍生自枯草芽孢杆菌的双链DNA的结合亲和力比ZCCHC3具有更强的结合亲和力。此外，ZCCHC3与HIV-1衍生的逆转录物的单链DNA的SL2区域结合，但发现ZCCHC3对SL2的结合亲和力很低。