自然免疫に重要なcGASを活性化するZCCHC3の作用機構の解明

阐明 ZCCHC3 激活 cGAS 的作用机制，这对先天免疫很重要

• 批准号: 22K06546
• 负责人: 水口 峰之
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: University of Toyama
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06546/
• 关键词: ZCCHC3; cGAS; タンパク質; 自然免疫; DNA結合; ゲルシフトアッセイ; DNA結合タンパク質; 立体構造

ヒトZCCHC3の大腸菌による大量発現系の構築を行った。全長ZCCHC3（1-403残基）のアミノ酸配列をコードするDNAを大腸菌用の発現ベクターに導入した。ZCCHC3は可溶化タグのLipoyl domainとの融合タンパク質として発現した。Lipoyl domainのN末端には精製用のHis-tagを付加した。Ni-NTA樹脂を用いてLipoyl domainとZCCHC3の融合タンパク質を精製し、その後TEVプロテアーゼでLipoyl domainとZCCHC3を切り離した。Lipoyl domainをNi-NTA樹脂で除去した後、ゲルろ過クロマトグラフィーでZCCHC3を精製した。LB培地800 mLの大腸菌培養液から、高純度のZCCHC3を十分量得ることに成功した。さらに、ZCCHC3の天然変性領域（1-160残基）の発現・精製にも取り組んだ。ZCCHC3の1-160残基のN末端にHis-tagを付加して大腸菌で発現し、Ni-NTA樹脂で精製したところ高純度のZCCHC3(1-160)を得ることができた。次に、ZCCHC3とDNAの相互作用をゲルシフトアッセイで調べた。その結果、天然変性領域の1-160残基フラグメントよりも全長ZCCHC3のほうがDNAに強く結合することがわかった。この実験では枯草菌由来の50 bpの二本鎖DNAを用いた。この枯草菌由来DNAは、自然免疫における重要なDNAセンサーであるcGASと複合体を形成し、cGASを活性化すると報告されている。また、cGASでもゲルシフトアッセイを行ったところ、枯草菌由来の二本鎖DNAに対する結合親和性は、ZCCHC3よりもcGASのほうが強いことが示された。さらに、ZCCHC3はHIV-1由来逆転写産物の一本鎖DNAのSL2領域と結合するが、SL2に対するZCCHC3の結合親和性は低いことがわかった。

There are a large number of bacteria in the ZCCHC3 system. The full-length ZCCHC3 (1-403residues) was used to insert DNA into E. coli. ZCCHC3 is soluble, Lipoyl domain, fusion, fusion, melting, fusion, fusion and fusion. The N-terminal essence of Lipoyl domain uses the word "His-tag" plus "pay". Ni-NTA fat is fused with "Lipoyl domain" ZCCHC3 "fusion" and then "TEV" and "ZCCHC3" after fusion. After the Lipoyl domain Ni-NTA fat has been removed, it is necessary to obtain a high performance ZCCHC3. LB Peidi 800mL and high temperature ZCCHC3 solution were tested successfully. In the field of natural sex (1-160bp), ZCCHC3 can be used to determine the quality of the tissue. The N-terminal His-tag of ZCCHC3 1-160 residues was detected by Ni-NTA, and the high concentration of ZCCHC3 (1-160) was obtained. The interaction between ZCCHC3 and DNA is different from each other. The results show that the total length of ZCCHC3 in the field of natural sex is 1-160. the results show that the whole length of the DNA is strong enough to combine the results of the experiment. The origin of Bacillus subtilis is 50 bp. It is used by ordinary universities and DNA universities. The origin of Bacillus subtilis DNA, natural immunity, the importance of DNA, the formation of cGAS complex, the activation of cGAS, the report of Bacillus subtilis. The combination of DNA, cGAS, and the origin of Bacillus subtilis are reported in this paper. The origin of DNA HC3HIV-1 is reverse. There is a book on the combination of DNA and ZCCHC3 in the field of HIV-1, the combination of HIV-1 and HIV1 in the field of ZCCHC3, and the combination of HIV-1 and HIV-1.