自然免疫に重要なcGASを活性化するZCCHC3の作用機構の解明

阐明 ZCCHC3 激活 cGAS 的作用机制，这对先天免疫很重要

• 批准号: 22K06546
• 负责人: 水口 峰之
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: University of Toyama
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06546/
• 关键词: ZCCHC3; cGAS; タンパク質; 自然免疫; DNA結合; ゲルシフトアッセイ; DNA結合タンパク質; 立体構造

ヒトZCCHC3の大腸菌による大量発現系の構築を行った。全長ZCCHC3（1-403残基）のアミノ酸配列をコードするDNAを大腸菌用の発現ベクターに導入した。ZCCHC3は可溶化タグのLipoyl domainとの融合タンパク質として発現した。Lipoyl domainのN末端には精製用のHis-tagを付加した。Ni-NTA樹脂を用いてLipoyl domainとZCCHC3の融合タンパク質を精製し、その後TEVプロテアーゼでLipoyl domainとZCCHC3を切り離した。Lipoyl domainをNi-NTA樹脂で除去した後、ゲルろ過クロマトグラフィーでZCCHC3を精製した。LB培地800 mLの大腸菌培養液から、高純度のZCCHC3を十分量得ることに成功した。さらに、ZCCHC3の天然変性領域（1-160残基）の発現・精製にも取り組んだ。ZCCHC3の1-160残基のN末端にHis-tagを付加して大腸菌で発現し、Ni-NTA樹脂で精製したところ高純度のZCCHC3(1-160)を得ることができた。次に、ZCCHC3とDNAの相互作用をゲルシフトアッセイで調べた。その結果、天然変性領域の1-160残基フラグメントよりも全長ZCCHC3のほうがDNAに強く結合することがわかった。この実験では枯草菌由来の50 bpの二本鎖DNAを用いた。この枯草菌由来DNAは、自然免疫における重要なDNAセンサーであるcGASと複合体を形成し、cGASを活性化すると報告されている。また、cGASでもゲルシフトアッセイを行ったところ、枯草菌由来の二本鎖DNAに対する結合親和性は、ZCCHC3よりもcGASのほうが強いことが示された。さらに、ZCCHC3はHIV-1由来逆転写産物の一本鎖DNAのSL2領域と結合するが、SL2に対するZCCHC3の結合親和性は低いことがわかった。

The large presence of ヒトZCCHC3 escherichia coli による is due to the formation of を rows った. Span ZCCHC3 residues (1-403) の ア ミ ノ acid with column を コ ー ド す る DNA を coliform in の 発 now ベ ク タ ー に import し た. ZCCHC3 <s:1> can dissolve タグ <s:1> Lipoyl domainと <e:1> fuses with タ <e:1> パ intermediates と て て to form た. Lipoyl domain <s:1> n-terminal に に refining with <s:1> His-tagを plus <s:1> た. Ni - NTA resin by い を て Lipoyl domain と ZCCHC3 の fusion タ ン パ ク を refined し, そ の after TEV プ ロ テ ア ー ゼ で Lipoyl domain と ZCCHC3 を り cutting from し た. Lipoyl domain を Ni - で NTA resin to remove し た, ゲ ル ろ too ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー で ZCCHC3 を refined し た. 800 mL of LB Peidi <s:1> Escherichia coli culture medium とに ら, high-purity <s:1> ZCCHC3を ten parts る とに とに successful <s:1> た. Youdaoplaceholder0, ZCCHC3 sequence natural variation domain (1-160 residues) さらに occurrence · refinement に extract さらに group んだ. ZCCHC3 の 1-160 residues の N terminal に ihs - tag を plus し て coliform で 発 し now, Ni - NTA resin で refined し た と こ ろ high-purity の ZCCHC3 (1-160) を る こ と が で き た. Sub-に, ZCCHC3とDNA <s:1> interaction をゲ シフトアッセ シフトアッセ で で べた. そ の results, 1-160 - natural areas の residue フ ラ グ メ ン ト よ り も span ZCCHC3 の ほ う が DNA に strong く combining す る こ と が わ か っ た. <s:1> <s:1> empirical で で the origin of bacillus subtilis 50 bp <e:1> lock DNAを using た た. こ の hay bacteria DNA は origin, natural immune に お け る important な DNA セ ン サ ー で あ る cGAS と complex を し, cGAS を activeness す る と report さ れ て い る. ま た, cGAS で も ゲ ル シ フ ト ア ッ セ イ を line っ た と こ ろ, hay bacteria origin の 2 lock DNA に す seaborne る combined with affinity は, ZCCHC3 よ り も cGAS の ほ う が strong い こ と が shown さ れ た. さ ら に, ZCCHC3 origin product inverse planning write の は HIV - 1 a lock DNA の SL2 fields と す る が, SL2 に す seaborne る ZCCHC3 の combined with low affinity は い こ と が わ か っ た.