自然免疫に重要なcGASを活性化するZCCHC3の作用機構の解明

阐明 ZCCHC3 激活 cGAS 的作用机制，这对先天免疫很重要

• 批准号: 22K06546
• 负责人: 水口 峰之
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: University of Toyama
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06546/
• 关键词: ZCCHC3; cGAS; タンパク質; 自然免疫; DNA結合; ゲルシフトアッセイ; DNA結合タンパク質; 立体構造

ヒトZCCHC3の大腸菌による大量発現系の構築を行った。全長ZCCHC3（1-403残基）のアミノ酸配列をコードするDNAを大腸菌用の発現ベクターに導入した。ZCCHC3は可溶化タグのLipoyl domainとの融合タンパク質として発現した。Lipoyl domainのN末端には精製用のHis-tagを付加した。Ni-NTA樹脂を用いてLipoyl domainとZCCHC3の融合タンパク質を精製し、その後TEVプロテアーゼでLipoyl domainとZCCHC3を切り離した。Lipoyl domainをNi-NTA樹脂で除去した後、ゲルろ過クロマトグラフィーでZCCHC3を精製した。LB培地800 mLの大腸菌培養液から、高純度のZCCHC3を十分量得ることに成功した。さらに、ZCCHC3の天然変性領域（1-160残基）の発現・精製にも取り組んだ。ZCCHC3の1-160残基のN末端にHis-tagを付加して大腸菌で発現し、Ni-NTA樹脂で精製したところ高純度のZCCHC3(1-160)を得ることができた。次に、ZCCHC3とDNAの相互作用をゲルシフトアッセイで調べた。その結果、天然変性領域の1-160残基フラグメントよりも全長ZCCHC3のほうがDNAに強く結合することがわかった。この実験では枯草菌由来の50 bpの二本鎖DNAを用いた。この枯草菌由来DNAは、自然免疫における重要なDNAセンサーであるcGASと複合体を形成し、cGASを活性化すると報告されている。また、cGASでもゲルシフトアッセイを行ったところ、枯草菌由来の二本鎖DNAに対する結合親和性は、ZCCHC3よりもcGASのほうが強いことが示された。さらに、ZCCHC3はHIV-1由来逆転写産物の一本鎖DNAのSL2領域と結合するが、SL2に対するZCCHC3の結合親和性は低いことがわかった。

Construction of a large number of production systems for Escherichia coli from ZCCHC3 The full-length ZCCHC3 (residues 1-403) was introduced into DNA for development. ZCCHC3 is a fusion of soluble Lipoyl domains. The His-tag of the N-terminal of Lipoyl domain is refined. Ni-NTA resin is used to refine the fusion of Lipoyl domain and ZCCHC3, and the separation of Lipoyl domain and ZCCHC3 is used to purify the fusion of Lipoyl domain and ZCCHC3. After removing the Ni-NTA domain, the ZCCHC3 was refined. LB culture 800 mL of E. coli culture solution, high purity ZCCHC3, ten percent of the success. In addition, ZCCHC3 natural variable domain (residues 1-160) discovery, purification and selection of components. ZCCHC3 residues 1-160 N-terminal His-tag was added to Escherichia coli, Ni-NTA resin was purified and high purity ZCCHC3 (1-160) was obtained. The interaction between ZCCHC3 and DNA is regulated by DNA. As a result, residues 1-160 of the natural variant domain are strongly bound to full-length ZCCHC3. A 50 bp duplex DNA sequence was used in this study. The origin of DNA and natural immunity are important for the formation of cGAS complexes. The binding affinity between cGAS and DNA of Bacillus subtilis was studied. The binding affinity between cGAS and DNA was studied. In addition, ZCCHC3 has a low binding affinity for SL2 domain of DNA from HIV-1 reverse transcription products.