自然免疫に重要なcGASを活性化するZCCHC3の作用機構の解明

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ヒトZCCHC3の大腸菌による大量発現系の構築を行った。全長ZCCHC3（1-403残基）のアミノ酸配列をコードするDNAを大腸菌用の発現ベクターに導入した。ZCCHC3は可溶化タグのLipoyl domainとの融合タンパク質として発現した。Lipoyl domainのN末端には精製用のHis-tagを付加した。Ni-NTA樹脂を用いてLipoyl domainとZCCHC3の融合タンパク質を精製し、その後TEVプロテアーゼでLipoyl domainとZCCHC3を切り離した。Lipoyl domainをNi-NTA樹脂で除去した後、ゲルろ過クロマトグラフィーでZCCHC3を精製した。LB培地800 mLの大腸菌培養液から、高純度のZCCHC3を十分量得ることに成功した。さらに、ZCCHC3の天然変性領域（1-160残基）の発現・精製にも取り組んだ。ZCCHC3の1-160残基のN末端にHis-tagを付加して大腸菌で発現し、Ni-NTA樹脂で精製したところ高純度のZCCHC3(1-160)を得ることができた。次に、ZCCHC3とDNAの相互作用をゲルシフトアッセイで調べた。その結果、天然変性領域の1-160残基フラグメントよりも全長ZCCHC3のほうがDNAに強く結合することがわかった。この実験では枯草菌由来の50 bpの二本鎖DNAを用いた。この枯草菌由来DNAは、自然免疫における重要なDNAセンサーであるcGASと複合体を形成し、cGASを活性化すると報告されている。また、cGASでもゲルシフトアッセイを行ったところ、枯草菌由来の二本鎖DNAに対する結合親和性は、ZCCHC3よりもcGASのほうが強いことが示された。さらに、ZCCHC3はHIV-1由来逆転写産物の一本鎖DNAのSL2領域と結合するが、SL2に対するZCCHC3の結合親和性は低いことがわかった。