蛋白質のスローフォールディングにおける水の役割

水在减缓蛋白质折叠中的作用

基本信息

批准号：
18031013
负责人：
水口峰之
金额：
$ 3.33万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

超好熱菌PCPと中温菌PCPのキメラタンパク質を作製し安定性やアンフォールディング速度について調べた。超好熱菌PCPと中温菌PCPの立体構造を比較すると、超好熱菌PCPのC末端領域にはαヘリックスが2本(α5とα6)あるが、中温菌PCPではヘリックスの一部がループ構造になっている。そこで、超好熱菌PCPの異常に遅いアンフォールディングはC末端構造の違いによると予想し、数種類のキメラタンパク質を作製し実験を行った。超好熱菌PCPの174-208残基を中温菌PCPにしたキメラでは大きく不安定化したが、174-183残基だけを中温菌PCPに変えたキメラでは不安定化の程度はかなり小さかった。また、174-208残基を中温菌PCPにしたキメラではアンフォールディング速度が著しく増加した。したがって、超好熱菌PCPの高い熱安定性と異常に遅いアンフォールディングはC末端に位置する174-208残基の構造によることが明らかになった。また、超好熱菌PCPのC末端半分に相当する113-208残基のフラグメントPCP(113-208)を作製し、NMRによってその特徴を調べた。その結果、PCP(113-208)はマイクロ〜ミリ秒で運動しておりコンフォメーション交換の状態にあることがわかった。次に、さまざまな濃度の尿素存在下でPCP(113-208)の^1H-^<15>N HSQCを測定し変性過程について調べた。スペクトル上で分離していた複数のピークについて強度と^<15>Nケミカルシフトをプロットしたところ、PCP(113-208)の尿素変性は非協同的で徐々に起こることが示された。以上の結果から、超好熱菌PCPのフォールディングでは、フォールディング初期にC末端半分だけがモルテングロビュール様の構造をもつ中間体(D1状態)となり、その中間体は非協同的な相互作用によって安定化されていることがわかった。

制备了高疗和中等PCP的嵌合蛋白，并研究了稳定性和展开速率。比较了高疗PCP和中粒PCP的三维结构，在高疗PCP的C末端区域中有两个α-螺旋（α5和α6），但在中嗜PCP中，某些螺旋螺旋具有循环结构。因此，我们预测，高疗细菌PCP的异常缓慢展开是由于C末端结构的差异，并且通过产生几种类型的嵌合蛋白来进行实验。嵌合体将残基174-208转化为中嗜性pcp，不稳定程度显着降低，其中残基174-183被转化为嗜嗜性pcp。此外，嵌合体中的展开率显着增加，残基174-208变成了嗜嗜性pcp。因此，据表明，高热稳定性PCP的高热稳定性和异常缓慢的展开是由于位于C端的174-208的残基的结构所致。此外，制备了带有残基113-208的片段PCP（113-208），该片段与高疗中心PCP的C末端一半相对应，并通过NMR检查了其特性。结果表明，PCP（113-208）正在微毫秒秒中移动，并且处于构象交换状态。接下来，在存在各种浓度的尿素的情况下测量了PCP的 ^1H - ^<15> N HSQC（113-208），并研究了变性过程。将强度和 ^<15> N的化学位移绘制为在光谱上分开的多个峰，这表明PCP的尿素变性（113-208）是非合并性和进行性的。从上面的结果中可以发现，在折叠式PCP的折叠中，只有C末端成为中间体（D1状态），在折叠开始时具有MortEngulfur样结构，并且该中间体通过非合作性相互作用稳定。