蛋白質表面における膜相互作用部位の決定方法とその応用

确定蛋白质表面膜相互作用位点的方法及其应用

基本信息

批准号：
18689002
负责人：
水口峰之
金额：
$ 14.14万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18689002/
关键词：
タンパク質膜相互作用 NMR 光CIDNP MAP-LC3 GABARAP

项目摘要

本研究では、蛋白質と膜との間の弱い相互作用を検出する新しい手法を開発し、その手法を用いて細胞内の物質輸送蛋白質に応用し小胞輸送を分子レベルで解明する。オートファゴソームに結合するMAP-LC3とdodecylphosphocholine(DPC)ミセルの相互作用を光CIDNP法を用いて研究した。MAP-LC3とDPCが共存する系で脂溶性色素を用いて光CIDNP実験を行うと、His86のε1プロトン、His86のδ2プロトン、およびTyr38のε1,2プロトンの位置で光CIDNP効果が認められた。その他には、His57のε1のシグナルについても弱い光CIDNP信号が観測された。それに対して、DPCが存在しない系では、His57,His86,Tyr38の信号に加えて、His27のε1とHis57のδ2に由来する光CIDNPシグナルも観測された。これらの結果から、MAP-LC3はHis86とTyr38の近傍でDPCミセルに結合していると予想された。また、NMRによる立体構造解析の結果、これらの二つの残基は立体構造上隣接していることもわかった。さらに、DPC結合状態でのMAP-LCについてもNMRによる立体構造解析を行い、90%以上のNMRシグナルを帰属することができた。前年度に引き続き、MAP-LC3のホモログであるGABARAP蛋白質についてNMRシグナルの帰属を行い、従来の方法を用いて立体構造計算を行った。さらに、GABARAPとDPCの相互作用をHSQCによって追跡し、GABARAPのDPC結合表面を予測した。また、MAP-LC3と同様にGABARAPについても光CIDNP実験を行ったところ、N末端領域に位置するTyr残基の光CIDNPシグナルがMAP-LC3と異なっていた。

在这项研究中，我们开发了一种用于检测蛋白质与膜之间弱相互作用的新方法，并将使用该方法将其应用于细胞内的物质转运蛋白，以阐明分子水平的囊泡转运。使用PhotoCidnp方法研究了十二烷基磷胆碱（DPC）胶束与MAP-LC3结合与自噬体的相互作用。当使用Lipo-溶剂染料进行PhotoCidNP实验，在该系统中，MAP-LC3和DPC共存的系统时，在His86，His86的Δ2质子的ε1质子的位置观察到了光肽效应，His86和Tyr38的ε1,2蛋白。另外，对于His57的ε1信号，还观察到弱光学CIDNP信号。相反，还观察到还观察到His27的ε1和His57的His57，His86和Tyr38的信号，除了His57，His86和Tyr38的信号外，还观察到了His57的光学CIDNP信号。这些结果表明，MAP-LC3与His86和Tyr38附近的DPC胶束绑定。此外，NMR分析的结果表明，这两个残基在构象上相邻。此外，DPC结合状态中的MAP-LC还进行了NMR构象分析，并且可以分配超过90％的NMR信号。从上一年开始，将NMR信号分配给GABARAP蛋白，MAP-LC3的同源物，并使用常规方法进行了三维结构计算。此外，HSQC跟踪Gabarap和DPC之间的相互作用，以预测Gabarap的DPC结合表面。另外，类似于MAP-LC3，当对Gabarap进行光学CIDNP实验时，位于N末端区域的Tyr残基的光学CIDNP信号与MAP-LC3的光学cidnp信号不同。