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酵母発現システムを用いたp53蛋白の転写機能調節因子の同定

利用酵母表达系统鉴定p53蛋白转录功能调节因子

基本信息

批准号：
08877034
负责人：
佐谷秀行
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08877034/
关键词：
酵母 p53遺伝子転写因子発現クローニング

项目摘要

癌抑制遺伝子p53の産物は、DNAに損傷が加わるとそのシグナルを受けて細胞内に蓄積し、様々な遺伝子の転写を誘導することが分かっている。しかし、p53蛋白の転写活性の制御機構は今だ明確にされていない。本研究は、酵母発現系を用いて、p53の転写活性を抑制する蛋白を見いだし、その生化学的性質を解析することを目的とした。本年度の成果を要約すると:1)ウラシル要求性酵母株の樹立:cDNAライブラリーを構築したpYEUra3ベクターは、Ura3遺伝子を選択マーカーとしてを持っているため、ホストである酵母細胞yIG397細胞をウラシル要求株へ改変した(yIG397/wtp53/ura-と命名)。yIG397/wtp53/ura-細胞はura(+)培地上にて白色のコロニーを形成した。2)変異型p53遺伝子の導入:yIG397/wtp53/ura-細胞に変異型p53遺伝子を導入後、トランスフォームした細胞をウラシル(-)培地で選別したところ、赤色コロニーを得た。変異型p53は、酵母内で正常型p53の働きをドミナントネガティブに抑制していることが分かり、本システムが作動することが確認できた。3)p53転写機能を阻害するcDNAの選別:ヒトcDNAライブラリーを導入後、ウラシル(-)培地で選別したところ、約150個の赤色コロニーを得た。これらのクローンからプラスミドを回収し、再びyIG397/wtp53/ura-細胞に導入したところ、約90%のクローンにおいて白色のコロニーを形成した。つまり、初回のスクリーニングにおいて、酵母細胞内でp53遺伝子、p53responsive promoter、ADE2遺伝子のいずれかに変異が生じ、cDNAの導入とは関係なく、レポーターシステムに異常が生じたものが大半であることが分かった。現在、二次スクリーニングで陽性となったクローンの特性解析を実施中である。

The product of cancer suppressor gene p53 increases DNA damage and induces intracellular accumulation and gene transcription. The regulatory mechanism of p53 protein activity is now clearly defined. This study aims to identify the role of yeast expression systems, inhibit p53 activity, and analyze the biochemical properties of proteins. The results of this year are as follows:1) Establishment of required yeast strains:cDNA generation, construction of pYEUra3, Ura3 gene selection, yeast cell yIG397 cell generation, required strain generation (yIG397/wtp53/ura-). yIG397/wtp53/ura-Cell Uura (+) culture ground white 2) Introduction of heteromorphic p53 gene: yIG397/wtp53/ura-cells After introduction of heteromorphic p53 gene, cells were selected and identified. p53 heteromorphic, yeast and normal p53 are identified by their presence and absence. 3) Selection of cDNA with p53-encoding function: After introduction of p53-encoding cDNA, about 150 red cDNA fragments were selected. About 90% of the cells were introduced into the IG397/wtp53/ura-cell, and the white cells were formed. P53 gene, p53responsive promoter, ADE2 gene, cDNA introduction, gene mutation, gene mutation. Now, the second time, the characteristic analysis of the positive and negative factors is implemented.