タイトジャンクションの構成分子オクルディンの高次構造と結合タンパク質の研究

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前年度の研究の進展から引き続き、オクルディンと挙動を共にするという性質を利用して同定することに成功した、タイトジャンクションの新しい膜タンパク質クローディン-1,-2の機能解析を優先的に行った。最も重要な研究成果は、クローディン-1,-2が構造タンパク質として実際にタイトジャンクションを形成する強い活性を有することが確かめられたことである。タイトジャンクションをもたないマウス線維芽細胞であるL細胞に、DNAトランスフェクション法によってクローディン-1,-2を強制発現させたところ、発現したクローディンタンパク質は、細胞と細胞の接着部位と思われるところに線状のネットワークを描いて濃縮した。2種類のエピトープタグを人為的に結合させたクローディン-1をL細胞にそれぞれ発現させて混合培養する実験から、クローディンの細胞間への濃縮はホモフィリック、つまり細胞間におけるクローディン対クローディンの相互作用によるものであることが示された。これはクローディンがタイトジャンクショシの接着分子であることを示唆し、実際にクローディンを大量に発現しているL細胞は細胞接着能を示した。さらにフリーズフラクチャー法によってこの細胞を電子顕微鏡レベルで観察したところ、細胞間接着部位においてクローディンが、非常に発達したタイトジャンクショシのストランド構造を形成していることが明らかになった。オクルディンをこの細胞に重ねて発現させると、クローディンの形成するタイトジャンタションにオクルディンがリクルートされた。以上はタイトジャンクションにおけるクローディンの機能として決定的なものといえる。また、データベースからクローディン-1,-2のサブタイプと考えられるcDNA配列を複数得て、抗体の作製と、トランスフェクションによる機能解析から、これらが実際にクローディンファミリーであることを証明した。これらサブタイプ間の相互作用の可能性を現在検討中である。