肺胞上皮細胞を標的とした遺伝子治療の基礎的研究

肺泡上皮细胞基因治疗基础研究

• 批准号: 08770440
• 负责人: 青木 薫
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Jikei University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770440/
• 关键词: 遺伝子治療; 肺胞上皮細胞; 特発性間質性肺炎; thyroid transcription factor1

近年遺伝子治療研究は後天性疾患にも適応が拡大され,積極的な臨床導入が図られつつある.有効な治療法がなく予後不良の疾患であるARDSや特発性間質性肺炎に対する治療を目的とした外来性の遺伝子導入の試みとして,病変の場である肺胞領域で増殖した再生II型肺胞上皮細胞への安全な選択的遺伝子導入を可能にするためのプラスミドベクターの構築に関して,最初に肺胞上皮細胞を用いたin vitroの系で検討した.LacZ遺伝子の発現プラスミドベクターであるpCMVβに肺胞上皮細胞特異的発現を規定していると考えられるサーファクタント蛋白(SP)-B遺伝子5'上流域のthyroid transcription factor1(TTF-1)の結合部位塩基配列を正逆いずれかの方向に挿入したベクターpCMV-TTF1-β/forおよびpCMV-TTF1-β/revを作製し,Liposomeとの複合体形成後,肺胞上皮癌細胞株A549にtransfectした.pCMVβでtransfectした細胞を対照とし,導入されたβ-galactosidase(β-gal)遺伝子の発現とその増強の程度を,A549にX-galを添加後,位相差顕微鏡による観察ならびに細胞内のβ-gal活性値を基質ONPGを加えた発色反応により測定し,比較検討した.位相差顕微鏡による観察では,pCMVβとpCMV-TTF1-β/forないしpCMV-TTF1-β/revとの間にβ-gal発現細胞の数および程度に明らかな差は認められず,またβ-gal蛋白の活性値に関しても3群間では差を認めなかった.これはA549細胞のTTF-1発現の程度が低いためと考えられ,肺胞上皮細胞特異的発現のためにTTF-1発現ベクターのcotransfectionが必要であることが示唆された.今後は更にin vitroの系を用いてベクターへのTTF-1結合部位認識配列の付加がII型肺胞上皮細胞への特異的遺伝子導入を試みる場合に有用であるか否かを検討し,その後にbleomycin投与マウス肺線維症モデルを用いたin vitroでの遺伝子導入実験を施行し,更には同モデルを用いて治療遺伝子の導入実験も試みる予定である.

In recent years, the research on the treatment of acquired diseases has been greatly expanded, and active clinical introduction has been carried out. There are therapeutic methods for the treatment of adverse diseases such as ARDS and idiopathic interstitial pneumonia. The purpose of treatment is to try to introduce exogenous gene into lung cells. The field of disease is to proliferate and regenerate type II lung epithelial cells. The safe selection of gene introduction is possible. Initially, the expression of LacZ gene in vitro was studied. The expression of pCMVβ protein in lung epithelial cells was regulated. The binding site of thyroid transcription factor1(TTF-1) in the upper region of B gene was studied. The binding site of TTF-1 was studied in the reverse direction. After the formation of Liposome complex, the expression of β-galactosidase(β-gal) gene in A549 cells was enhanced. After the addition of X-gal to A549 cells, the activity of β-gal in cells was detected by phase contrast microscopy. Phase contrast microscopy revealed that pCMVβ and pCMV-TTF1-β/for pCMV-TTF1-β/rev were related to the number of β-gal developing cells and the activity of β-gal protein. The expression of TTF-1 in A549 cells was lower than that in lung epithelial cells. In the future, we will further investigate whether it is useful to use bleomycin in vitro system to recognize the alignment of TTF-1 binding sites and to increase the specific gene introduction of type II lung epithelial cells, and then to implement the gene introduction in vitro system, and further to determine the gene introduction in vitro system.