膜型ADAM結合分子のクローニングと機能解析

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ADAM(A Disintegrin And Metalloproteinase)分子は、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)のメタロプロテアーゼドメインを共有するMMP近縁遺伝子ファミリーである。ADAMは細胞膜貫通ドメインをもつ膜型ADAMとスロンボスポンジン(TS)ドメインをもつ分泌型ADAMTSに大別されている。本研究では、膜型ADAMと相互作用する分子群を酵母two-hybrid systemでスクリーニングすることにより、酵素の基質やインヒビター、細胞機能制御因子を同定し、膜型ADAMの性質を解明することを目的としている。膜型ADAMの代表としてADAM28を標的とし、本分子のディスインテグリンドメインからcysteine-richドメインまでをコーディングするcDNAをbaitとしてDNA-binding vectorを作成した。次いで、市販のヒト肺組織cDNAライブラリーを組み込んだDNA-activation domain vectorを上記のbaitと共に酵母Y190株に発現し、ヒスチジン要求性とβ-ガラクトシダーゼアッセイにてスクリーニングした。その結果、215個の陽性クローンを得、ダイレクトシークエンスした。得られたクローンのうち、connective tissue growth factor、pulmonary-associated protein A2、P-selectin ligandなどに的を絞って結合能や結合ドメインを検討している。また、ADAM28の全長とメタロプロテアーゼドメインをコーディングするcDNAをクローニングし、FLAG-tagを付けたリコンビナントADAM28を精製し、上記で得られた基質候補分子の分解作用を検討中である。