個体レベルでの細胞周期のリアルタイムイメージングの試み

尝试在个体水平上对细胞周期进行实时成像

基本信息

批准号：
17659079
负责人：
北川雅敏
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Hamamatsu University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17659079/
关键词：
細胞周期サイクリン p27

项目摘要

[目的]本研究は細胞周期のリアルタイムイメージングを行うため、細胞周期特異的遺伝子であるp27^<Kip1>およびサイクリン遺伝子群に注目してその量的制御機構を解析する。さらにその知見を利用して細胞周期のリアルタイムイメージングを目指す。[研究成果]グリオブラストーマ細胞であるT98G細胞に血清飢餓かつ接触阻止を施し、GOに同調し、その後トリプシン処理で回収し、蒔き直しで10%血清を含む培地で細胞周期をG1期に進行させた。0時間から28時間まで3時間ごと経時的に細胞を回収し、細胞抽出液を調整し、ウエスタンプロットを行った。蛋白質発現の観察はp27^<Kip1>、サイクリンD1,サイクリンE、サイクリンA、サイクリンB、p53を対象として細胞周期における発現パターンを解析した。p27^<Kip1>はGO/G1において既に発現しているので転写より分解によって発現量が変動する。我々はp27^<Kip1>の新たなユビキチンリガーゼとしてPirh2を同定した。そこでp27^<Kip1>の分解に関与する既知のユビキチンリガーゼSkp2に加えPirh2の発現変動も解析対象に加えた。その結果、G1後期でサイクリンEが上昇、S期に開始と同時にサイクリンAが発現し、G2/MでサイクリンBが急増した。一方でp27^<Kip1>はG1期中期から減少し、それに対応してPirh2はG1期中期から徐々に発現が上昇した。Skp2の発現はS期から亢進することがわかった。p53はこの細胞では変異型のため細胞周期を通じて安定であった。これらの分子を追跡することで細胞周期のモニターが可能なことが判明した。一方でサイクリンD1のレポーターアッセイ系を構築し、サイクリンD1の細胞周期依存的転写を観察出来るようになった。

[目的]这项研究的重点是细胞周期特定基因p27^<kip1>和细胞周期蛋白基因组，以分析其定量调节机制，以便对细胞周期进行实时成像。此外，我们的目标是利用这些知识来实时成像细胞周期。 [研究结果] T98G细胞（一种胶质母细胞瘤细胞）受到血清饥饿和接触抑制的约束，并与GO同步，然后通过胰蛋白酶促成，并重新种子，以使细胞周期在含有10％血清的培养基中以G1的发展为G1相。每3小时从0到28小时收集细胞，调整细胞提取物，并进行西部图。分析细胞周期表达模式的p27^<kip1>，cyclin d1，cyclin E，Cyclin A，Cyclin B和P53。由于p27^<kip1>已经在GO/G1中表达，因此表达式水平随降解而不是转录而变化。我们将PIRH2确定为P27^<kip1>的新型泛素连接酶。因此，除了涉及p27^<kip1>降解的已知泛素连接酶SKP2外，PIRH2的表达变化还添加到了分析主题中。结果，Cyclin E在G1阶段后期增加，Cyclin A在S期开始同时表达，而Cyclin B在G2/M中迅速增加。另一方面，p27^<kip1>从中期G1相降低，而响应中，PIRH2表达逐渐从Mid-G1相增加。发现SKP2表达从S相增加。由于其突变形式，p53在整个细胞周期中都是稳定的。发现通过跟踪这些分子可以进行细胞周期监测。另一方面，已经构建了细胞周期蛋白D1的报告基因测定系统，使我们能够观察细胞周期依赖性细胞周期D1的转录。