系列特異的細胞消去法を応用した免疫細胞の生体内機能解析

使用谱系特异性细胞消除方法对免疫细胞进行体内功能分析

基本信息

批准号：
18659109
负责人：
烏山一
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

系列特異的細胞消去法による免疫細胞の機能解析のシステムを立ち上げるためのモデルスタディとして、これまで機能解析がほとんど進んでいない好塩基球を標的とした好塩基球欠損マウスの樹立を目標に研究を進めた。前年度の研究で、BACクローン上で相同組み換え技術を応用して、好塩基球特異的に発現しているプロテアーゼmMCP-8をコードする遺伝子の蛋白コード領域をジフテリア毒素遺伝子あるいは緑色蛍光色素(GFP)遺伝子に置換したコンストラクトを作製した。本年度は、緑色蛍光色素遺伝子に置換したコンストラクトをマウス受精卵に導入し、BACトランスジェニックマウスの樹立を試みた。生まれてきた子マウスの尾DNAの解析から、低頻度ながら、BAC由来遺伝子が組み込まれた子マウス数匹を得た。それらのマウスの末梢血をフローサイトメトリーで解析したところ、いずれのマウスにおいてもCD49b陽性FcεRI陽性の好塩基球におけるGFPの発現が確認されなかった。そこで、mMCP-8遺伝子を含む別のBACクローンを用いて、GFP置換コンストラクトを作製しなおした。このコンストラクトをin vitroでマウス骨髄細胞に導入したところ、好塩基球特異的にGFPが発現されることが確認された。そこでこのコンストラクトをマウス受精卵に導入したところ、生まれてきた子マウスの一部で、末梢血中の好塩基球におけるGFPの発現が確認された。現在、この好塩基球GFP陽性マウスの子孫を育成中であり、これらのマウスで好塩基球特異的なGFP発現が再度確認されれば、GFPの代わりにジフテリア毒素遺伝子を組み込んだBACコンストラクトを作製して、マウス受精卵に導入する予定である。

作为启动使用谱系特异性细胞消除免疫细胞功能分析系统的模型研究，进行了研究，目的是建立靶向嗜碱性粒细胞嗜碱性粒细胞的嗜碱性粒细胞的小鼠，这些小鼠尚未在功能上进展。在上一年的研究中，将同源重组技术应用于BAC克隆，以创建一种构造，其中编码编码蛋白酶MMCP-8的蛋白质编码区域（在bas粒细胞中特异性表达）被二胆透析毒素基因或绿色含量基因或绿色含量（GFPPPP）基因代替。今年，我们引入了一种用绿色荧光染料基因代替的构造中，并试图建立BAC转基因小鼠。对出生的小鼠的尾巴DNA进行的分析表明，尽管很少经常使用BAC衍生基因的几种哺乳动物。通过流式细胞术分析了这些小鼠的外围血液，并且在两只小鼠中都证实了CD49B阳性FCεRI阳性嗜碱性粒细胞中GFP的表达。因此，使用另一个包含MMCP-8基因的BAC克隆重新创建GFP替代构建体。当该构建体在体外引入小鼠骨髓细胞中时，可以证实GFP在嗜碱性粒细胞中特别表达。因此，将这种构建体引入小鼠受精卵中，并在某些出生的儿童小鼠中证实了粒细胞中粒细胞中的GFP表达。目前，这些嗜碱性GFP阳性小鼠的后代正在培养中，如果在这些小鼠中再次确认嗜碱性粒细胞特异性的GFP表达，将在这些小鼠中再次确认，将产生含白喉毒素基因的BAC构造，代替GFP，并将其引入受精小鼠卵。