精巣特異的RNA・DNAハイブリッドの解析とアンチセンス工学への応用

睾丸特异性 RNA/DNA 杂交体的分析及其在反义工程中的应用

• 批准号: 14656132
• 负责人: 柏原 真一
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14656132/
• 关键词: RNA・DNAハイブリッド; アンチセンス治療; RNase H; ノックアウトマウス; RNA分解; 精子形成

生体内で効果的に機能するアンチセンスオリゴヌクレオチド(AS ODN)をデザインすることを目的として,生体内RNA・DNAハイブリッドの特性や内在性のRNase Hとの関連,およびDNAハイブリッド形成部位について検討した。(1)生体内RNA・DNAハイブリッドの特性…大腸菌RNase HによるRNA分解は当初精巣特異的であると思われたが,酵素量の増加あるいは反応時間を延長することにより,調べる限りすべての組織のRNAが感受性を示すことが明らかとなった。また,分解産物はノーザンブロット上で複数の明確なハンドとして検出されることや,RNase Hに対する感受性はmRNAにより異なることなどから,DNAはmRNA上の特定部位にハイブリダイズしていることが示唆された。さらに,プライマーを外部から加えなくても逆転写酵素によりcDNA合成が可能であったことから,RNA・DNAハイブリッドの存在がより明確となった。(2)哺乳動物RNase Hの局在解析…哺乳動物細胞で報告されている2つのRNase Hについて,それぞれに特異的な抗体を作製し解析した結果,RNase H1がおもに核とミトコンドリア画分に存在するのに対し,RNase H2は細胞質に局在していた。RNase H2の細胞質でのRNA・DNAハイブリッド分解への関与を明らかにすることを目的として,遺伝子欠損マウスの作製を試みた。2ラインの変異ES細胞に由来するヘテロ変異マウスが得られ,それぞれのヘテロマウス間での交配を行なったがホモ変異産仔は得られなかった。したがって,胎生致死であることが考えられ,RNase H2がRNA・DNAハイブリッド分解を介して,個体発生あるいは細胞機能の発現に必須な役割を果たしていることが示唆された。(3)ハイブリッド形成部位の同定…アクチンmRNAについて,reverse ligation-mediated PCRにより切断産物のcDNAを増幅した。それらの末端塩基配列を決定した結果,ハイブリッド形成部位にはある程度の傾向性が存在することが示された。今後は,切断部位の配列情報にもとづいて合成したAS ODNの標的遺伝子に対する発現抑制効果を解析することにより,このアプローチのAS ODNのデザインに対する有効性を検証する予定である。

Born the body could promote behavior fruit で す に function る ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド (AS ODN) を デ ザ イ ン す る こ と を purpose と し て, born in RNA, DNA ハ イ ブ リ ッ ド の features や internality の RNase H と の masato, お よ び DNA ハ イ ブ リ ッ ド forming parts に つ い て beg し 検 た. (1) The characteristics of RNA · DNAハ, ブリッド and ブリッド in the living body... Coliform RNase H に よ る は had fine 巣 specific RNA decomposition で あ る と think わ れ た が, enzyme in の raised add あ る い は anti 応 を prolonged す る こ と に よ り, adjustable べ る limit り す べ て の organization の RNA が susceptibility を shown す こ と が Ming ら か と な っ た. ま た, decomposition product は ノ ー ザ ン ブ ロ ッ ト で plural の clear な ハ ン ド と し て 検 out さ れ る こ と や, RNase H に す seaborne る susceptibility は mRNA に よ り different な る こ と な ど か ら, DNA は mRNA in specific areas の に ハ イ ブ リ ダ イ ズ し て い る こ と が in stopping さ れ た. さ ら に, プ ラ イ マ ー を external か ら plus え な く て も inverse planning write enzyme に よ り cDNA synthesis が may で あ っ た こ と か ら, RNA, DNA ハ イ ブ リ ッ ド の is が よ り clear と な っ た. (2) Mammalian RNase H localization in analysis... Mammalian cells で report さ れ て い る 2 つ の RNase H に つ い て, そ れ ぞ れ に し parse the specific antibody を な cropping し た results, RNase H1 が お も に nuclear と ミ ト コ ン ド リ ア painting existence に す る の に し seaborne, RNase H2 は cytoplasm に bureau in し て い た. RNase H2 の cytoplasm で の RNA, DNA ハ イ ブ リ ッ ド decomposition へ の masato Ming ら を か に す る こ と を purpose と し て, heritage 伝 son owe loss マ ウ ス の cropping を try み た. 2 ラ イ ン の - different ES cells に origin す る ヘ テ ロ - different マ ウ ス が have ら れ, そ れ ぞ れ の ヘ テ ロ マ ウ ス で between line の mating を な っ た が ホ モ - different breed は must ら れ な か っ た. し た が っ て, viviparous death で あ る こ と が exam え ら れ, RNase H2 が RNA, DNA ハ イ ブ リ ッ ド decomposition を interface し て, individuals born 発 あ る い は cell function の 発 に must now cut を な service fruit た し て い る こ と が in stopping さ れ た. (3)ハ ハ ブリッド formation site ハ fixed... Youdaoplaceholder0, チ, チ mRNAに, た, て て,reverse ligation-mediated PCRによ <e:1> cut the product of <s:1> cDNAを increase of た. そ れ ら の end salt base with column を decided し た results, ハ イ ブ リ ッ ド forming parts に は あ の tendentiousness が る extent す る こ と が shown さ れ た. Future は, cut off site の match column intelligence に も と づ い て synthetic し た AS ODN の mark heritage 伝 son に す seaborne る 発 now working fruit を す analytical る こ と に よ り, こ の ア プ ロ ー チ の AS ODN の デ ザ イ ン に す seaborne る have sharper sex を 検 card す る designated で あ る.

项目成果

Kashiwabara, S. (他10名): "Regulation of spermatogenesis by testis-specific, cytoplasmic poly(A) polymerase TPAP"Science. 298・5600. 1999-2002 (2002)

Kashiwabara, S.（其他 10 人）：“睾丸特异性细胞质多聚腺苷酸聚合酶 TPAP 对精子发生的调节”《科学》298·5600（2002 年）。

Baba, D., Kashiwabara, S.(他6名): "Mouse sperm lacking cell surface hyaluronidase PH-20 can pass through the layer of cumulus cells and fertilize the egg"Journal of Biological Chemistry. 277・33. 30310-30314 (2002)

Baba, D.、Kashiwabara, S.（其他 6 人）：“缺乏细胞表面透明质酸酶 PH-20 的小鼠精子可以穿过卵丘细胞层并使卵子受精”《生物化学杂志》277・33。 2002）

Nishimura, H., Kim, E., Fujimori, T., Kashiwabara, S.(他3名): "The ADAM1a and ADAM1b genes, instead of the ADAM1(fertilin α)gene, are localized on mouse chromosome 5"Gene. 291・1-2. 67-76 (2002)

Nishimura, H.、Kim, E.、Fujimori, T.、Kashiwabara, S.（以及其他 3 名）：“ADAM1a 和 ADAM1b 基因，而不是 ADAM1（生育素 α）基因，位于小鼠 5 号染色体上”基因291・1-2。

Zhuang, T., Kashiwabara, S., Noguchi, J., Baba, T.: "Transgenic expression of testis-specific poly(A) polymerase TPAP in wild-type and TPAP-deficient mice"Journal of Reproduction and Development. (in press). (2004)

Zhuang, T.、Kashiwabara, S.、Noguchi, J.、Baba, T.：“野生型和 TPAP 缺陷小鼠中睾丸特异性多聚腺苷酸聚合酶 TPAP 的转基因表达”生殖与发育杂志。

Sugiura, S., Kashiwabara, S., Iwase, S., Baba, T: "Expression of a testis-specific form of TBP-related factor 2(TRF2)mRNA during mouse spermatogenesis"Journal of Reproduction and Development. 49・1. 107-111 (2003)

Sugiura, S.、Kashiwabara, S.、Iwase, S.、Baba, T：“小鼠精子发生过程中睾丸特异性形式的 TBP 相关因子 2(TRF2)mRNA 的表达”生殖与发育杂志 49・1。 .107-111 (2003)