Pー450の活性部位構造の解析

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部位特異的にアミノ酸置換したPー450camのCO結合型およびO_2結合型の紫外共鳴ラマンスペクトルを測定しFeーCーO伸縮振動,FeーCーO変角振動,OーO伸縮振動を測定し、次の結果を得た。(1)Pー450camの252番目のスレオニンをグリシン,セリン,アラニン,バリン,プロリンに置換したPー450の変異体のFeーCO伸縮振動は、それぞれ,472,476,480,483,487cm^<ー1>であった。天然型では481cm^<ー1>である。又、天然型で558cm^<ー1>だったFeーCーO変角振動は、変異体ではそれぞれ556、559、558、560cm^<ー1>であった。(2)FeーCO伸縮振動の結果から、Pー450camの酸素ポケットは、グリシン、セリン、アラニン、スレオニン、バリン、プロリンの順に立体障害により小さくなっている事が示唆された。この順番はアミノ酸側鎖の大きさの順序と大体一致しており、252番目のアミノ酸は配位したCOのすぐ近くに存在し、配位したCOの幾何学構造を変化させているという事で説明がついた。(3)天然型の251番目のアミノ酸はアスパラギン酸であるが、X線結晶構造解析の結果、178番目のリジン、186番目のアルギニンとのイオン結合により、酸素ポケットの構造を保持していると考えられるが、251番をアラニンに置換した変異Pー450camでは、FeーCO伸縮振動は486cm^<ー1>であり、配位したCOへの立体障害が非常に大きくなった事が判った。(4)Pー450camに配位したOーOの伸縮振動は、天然型では1141cm^<ー1>だが、252番目をセリン、アラニン、プロニンに置換した変異体、251番をアラニンに置換した変異体では、各々1137、1134、1136、1139cm^<ー1>であった。これは252番目のスレオニンは配位したO_2と特異的な相互作用をしている可能性を示唆する。