糖脂質硫酸転移酵素の活性発現機序

糖脂磺基转移酶活性表达机制

基本信息

批准号：
06267201
负责人：
本家孝一
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.糖脂質硫酸転移酵素(GST)を、EGF処理したヒト腎癌細胞(SMKT-R3、2.5X10^9個)から、基質アナローグをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを用いて均一にまで精製した。精製GSTは還元状態のSDS-PAGE上、分子量54,000であった。比活性は1.2μmol/min/mgで、これまでラット腎および精巣、マウス脳から精製したと報告されているGSTの比活性よりも約200倍以上高く、完全精製標品と思われた。精製GSTを用いた基質特異性実験で、GSTは脂質と結合した糖鎖の非還元末端β結合糖を認識することがわかった。同様の培養及び精製を5回繰り返し約10μgの精製標品を得、リシルエンドペプチダーゼで消化し、逆相HPLCにかけペプチド断片の分離を行ない、6つの断片について部分アミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列について既存のアミノ酸配列データベースを用いてホモロジー検索を行ったところ新規配列であるので、cDNAクローニングに着手した。2.SMKT-R3細胞の粗画分を用いてGg3Cerの硫酸転移反応を調べると、その産物はガラクトースに硫酸基のついたSM2aではなくて、末端N-アセチルガラクトサミンに硫酸基のついたSM2bであった。さらに、SM2aを基質としてSB2が合成された。このことから、SB2の合成経路はLacCer→SM3→SM2a→SB2であることが示唆された。3.ピリドキサルリン酸(PLP)は、GSTのPAPS認識部位近傍のリジン残基を修飾することにより、GST活性を非可逆的に不活化することを示した。チロシンキナーゼ阻害剤Genisteinを用いた検討で、SMKT-R3細胞ではEGFレセプター以外の内在性のチロシンキナーゼが活性化されており、これが自律増殖とGST発現の両者に働いている可能性が示唆された。

1。使用亲和色谱法使用底物类似物作为配体的亲和力色谱法将糖脂硫酸盐转移酶（GST）从EGF处理的人肾脏癌细胞（SMKT-R3，2.5x10^9）中纯化为均匀性。在降低的状态下，纯化的GST在SDS-PAGE上为54,000分子量。比活性为1.2μmol/min/mg，比GST的特异性活性高约200倍，GST先前据报道已从大鼠肾脏，睾丸和小鼠大脑中纯化，被认为是完全纯化的制剂。使用纯化的GST进行的底物特异性实验表明，GST识别出脂质结合糖的非还原末端β连锁糖。重复五次相同的培养和纯化，以获得大约10μg的纯化制剂，用赖氨酸内肽酶消化，并通过反向相位HPLC分离肽片段，并确定六个片段的部分氨基酸序列。使用现有的氨基酸序列数据库搜索获得的氨基酸序列是同源性的，并且由于它是一个新序列，因此进行了cDNA克隆。 2。当使用SMKT-R3细胞的粗馏分研究GG3CER的硫酸盐转移反应时，该产物不是半乳糖中硫酸基团的SM2A，而是硫酸盐中的SM2B，带有硫酸盐基团的末端N-乙酰乳糖胺。此外，使用SM2A作为底物合成SB2。这表明SB2的合成途径是laccer→SM3→SM2A→SB2。 3。吡啶毒素磷酸盐（PLP）已通过修饰GST的PAPS识别位点附近的赖氨酸残基来使GST活性异常失活。一项使用酪氨酸激酶抑制剂染料木黄酮的研究表明，在SMKT-R3细胞中激活了EGF受体以外的内源性酪氨酸激酶，这表明这可能会影响自主增殖和GST表达。