糖脂質硫酸転移酵素の活性発現機序

糖脂磺基转移酶活性表达机制

• 批准号: 06267201
• 负责人: 本家 孝一
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06267201/
• 关键词: 糖脂質; 糖鎖合成; 硫酸転移酵素; 酵素精製; チロシンキナーゼ; ピリドキサルリン酸; 腎癌; ヒト癌細胞

1.糖脂質硫酸転移酵素(GST)を、EGF処理したヒト腎癌細胞(SMKT-R3、2.5X10^9個)から、基質アナローグをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを用いて均一にまで精製した。精製GSTは還元状態のSDS-PAGE上、分子量54,000であった。比活性は1.2μmol/min/mgで、これまでラット腎および精巣、マウス脳から精製したと報告されているGSTの比活性よりも約200倍以上高く、完全精製標品と思われた。精製GSTを用いた基質特異性実験で、GSTは脂質と結合した糖鎖の非還元末端β結合糖を認識することがわかった。同様の培養及び精製を5回繰り返し約10μgの精製標品を得、リシルエンドペプチダーゼで消化し、逆相HPLCにかけペプチド断片の分離を行ない、6つの断片について部分アミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列について既存のアミノ酸配列データベースを用いてホモロジー検索を行ったところ新規配列であるので、cDNAクローニングに着手した。2.SMKT-R3細胞の粗画分を用いてGg3Cerの硫酸転移反応を調べると、その産物はガラクトースに硫酸基のついたSM2aではなくて、末端N-アセチルガラクトサミンに硫酸基のついたSM2bであった。さらに、SM2aを基質としてSB2が合成された。このことから、SB2の合成経路はLacCer→SM3→SM2a→SB2であることが示唆された。3.ピリドキサルリン酸(PLP)は、GSTのPAPS認識部位近傍のリジン残基を修飾することにより、GST活性を非可逆的に不活化することを示した。チロシンキナーゼ阻害剤Genisteinを用いた検討で、SMKT-R3細胞ではEGFレセプター以外の内在性のチロシンキナーゼが活性化されており、これが自律増殖とGST発現の両者に働いている可能性が示唆された。

1. Sugar fatty acid (GST) を planning shift enzyme, EGF 処 し た ヒ ト kidney cells (SMKT - R3, 2.5 X10 ^ 9) か ら, matrix ア ナ ロ ー グ を リ ガ ン ド と す る ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を with い て uniform に ま で refined し た. Refined GST reduced state <s:1> SDS-PAGE, molecular weight 54,000であった. Than active は 1.2 mu mol/min/mg で, こ れ ま で ラ ッ ト renal お よ び 巣, マ ウ ス 脳 か ら refined し た と report さ れ て い る GST の than active よ り も about 200 times more than the high く, fully refined standard product と わ れ た. Refined GST を with い た substrate specificity be 験 で, GST は lipid と combining し た sugar lock の the end of the yuan also beta combine sugar を know す る こ と が わ か っ た. With others in の train and び refined を 5 back Qiao り return し about 10 mu g の refined を had, リ シ ル エ ン ド ペ プ チ ダ ー ゼ で digestion し, reverse phase HPLC に か け ペ プ チ ド の fragment separation line を な い, 6 つ の fragment に つ い て part ア ミ ノ acid with column を decided し た. Have ら れ た ア ミ ノ acid with column に つ い て existing の ア ミ ノ acid with column デ ー タ ベ ー ス を with い て ホ モ ロ ジ ー 検 cable line を っ た と こ ろ new rules with column で あ る の で, cDNA ク ロ ー ニ ン グ に to し た. 2. の coarse drawing points を SMKT - R3 cells with い て Gg3Cer の planning to move the sulfate 応 を adjustable べ る と, そ の product は ガ ラ ク ト ー ス に sulfuric acid base の つ い た SM2a で は な く て, at the end of N - ア セ チ ル ガ ラ ク ト サ ミ ン に sulfuric acid base の つ い た SM2b で あ っ た. Youdaoplaceholder0, SM2aを matrix と てSB2が synthesis された. <s:1> と と ら, SB2 <s:1> synthetic route とが LacCer→SM3→SM2a→SB2である とが とが show された. 3. ピ リ ド キ サ ル リ ン acid (PLP) は, GST の PAPS know place nearly alongside の リ ジ ン residues を modified す る こ と に よ り, GST activity を non reversible に inactive す る こ と を shown し た. チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ resistance against one of Genistein を with い た beg で 検, SMKT - R3 cell で は EGF レ セ プ タ ー outside の internality の チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ が activeness さ れ て お り, こ れ が self-discipline raised colonization と GST 発 is の struck the に 働 い て い が る possibility in stopping さ れ た.