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糖脂質硫酸転移酵素の活性発現機序

糖脂磺基转移酶活性表达机制

基本信息

批准号：
06267201
负责人：
本家孝一
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.糖脂質硫酸転移酵素(GST)を、EGF処理したヒト腎癌細胞(SMKT-R3、2.5X10^9個)から、基質アナローグをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを用いて均一にまで精製した。精製GSTは還元状態のSDS-PAGE上、分子量54,000であった。比活性は1.2μmol/min/mgで、これまでラット腎および精巣、マウス脳から精製したと報告されているGSTの比活性よりも約200倍以上高く、完全精製標品と思われた。精製GSTを用いた基質特異性実験で、GSTは脂質と結合した糖鎖の非還元末端β結合糖を認識することがわかった。同様の培養及び精製を5回繰り返し約10μgの精製標品を得、リシルエンドペプチダーゼで消化し、逆相HPLCにかけペプチド断片の分離を行ない、6つの断片について部分アミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列について既存のアミノ酸配列データベースを用いてホモロジー検索を行ったところ新規配列であるので、cDNAクローニングに着手した。2.SMKT-R3細胞の粗画分を用いてGg3Cerの硫酸転移反応を調べると、その産物はガラクトースに硫酸基のついたSM2aではなくて、末端N-アセチルガラクトサミンに硫酸基のついたSM2bであった。さらに、SM2aを基質としてSB2が合成された。このことから、SB2の合成経路はLacCer→SM3→SM2a→SB2であることが示唆された。3.ピリドキサルリン酸(PLP)は、GSTのPAPS認識部位近傍のリジン残基を修飾することにより、GST活性を非可逆的に不活化することを示した。チロシンキナーゼ阻害剤Genisteinを用いた検討で、SMKT-R3細胞ではEGFレセプター以外の内在性のチロシンキナーゼが活性化されており、これが自律増殖とGST発現の両者に働いている可能性が示唆された。

1. Glycolipid sulfate transfer enzyme (GST), EGF treatment of renal cell carcinoma (SMKT-R3, 2.5X10^9), matrix degradation, and purification The purified GST was purified by SDS-PAGE and its molecular weight was 54,000. The specific activity of GST is 1.2μmol/min/mg, which is about 200 times higher than that of the completely purified standard. Purified GST uses matrix-specific enzymes, GST lipid binding enzymes and non-reducing terminal β-binding enzymes. Culture and purification of the same sample: 5 cycles of digestion, 5 cycles of purification, 10μg of purified standard, 6 cycles of separation of fragments, and determination of acid alignment. In this paper, we introduce a new method of DNA sequencing, which is based on DNA sequencing. 2.SMKT-R3 cells were isolated by crude analysis. Gg3Cer was used to modulate the sulfuric acid shift of SMKT-R3 cells.SMKT-R3 cells produced by Gg3Cer and SMKT-R3 cells were used to modulate the sulfuric acid shift of SMKT-R3 cells. SMKT-R3 cells produced by Gg3Cer were used to modulate the sulfuric acid shift of SMKT-R3 cells. SMKT-R3 cells produced by Gg3Cer were used to modulate the sulfuric acid shift of SMKT-R3 cells. SM2a matrix and SB2 matrix were synthesized. The synthesis circuit of SB2 is LacCer→ SM3 → SM2a → SB2. 3. The activity of GST is irreversible due to the modification of residues near the recognition site of GST by PLP. In this study, SMKT-R3 cells were used to investigate the possibility of activation of EGF and GST in vitro.