細菌型分泌マシナリーSRPの結晶構造解析

细菌分泌机制SRP的晶体结构分析

• 批准号: 13033003
• 负责人: 中村 幸治
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13033003/
• 关键词: シグナル認識粒子; 枯草菌; 分泌装置; SRP19; Ffh; シグナルペプチド; 再構成系; SRP RNA; 高次構造解析; タンパク質膜透過; 分泌マシナリー; ヒストン様タンパク質; 結晶構造解析

枯草菌SRPはこれまでの解析から、1種類のRNA(scRNA)と2種類の蛋白質(Ffh=50kDa、HBsu=10kDa)から構成されており、このうち、HBsuはホモダイマーとして結合している。いずれの蛋白質も、大腸菌での発現系を構築した。改良の結果、結晶解析に必要とされる量の確保を得た。これとすでに系の構築が終了しているFfhタンパク質、及び、試験管内で転写したscRNAにより、再構成SRPの生成に成功したが、結晶構造解析に必要な量の確保には至っていない。これは最高の効率が非常に低いことと、ショ糖密度勾配遠心法等での再現性に問題が生じている。細胞内でのSRPの含有量と増殖時期との関係を解析した結果、対数増殖期以降に比較的安定なSRPが多く存在することが明らかとなった。この結果を踏まえ、枯草菌菌体より、直接、SRP粒子の生成を試みた。その結果、枯草菌100リットル培養液より、結晶構造解析に必要なミリグラム単位のHBsu-Ffh-scmRNA複合体が精製できた。現在、結晶化に向けた条件検討を行っている。一方、ヒトSRPは、6種類のタンパク質と1種類のRNAからなる(SRP RNA)。SRP RNAは、300塩基からなるが全体的に塩基対合を形成し、特徴的な2次構造を持つ。機能上これらの構造は4ドメインからなると推測される。6種類のタンパク質うち、シグナル認識に直接関与し、これと結合するSRP54タンパク質はSRP RNAのドメインIVへの結合に際し、SRP19が別のドメインIIIに結合することが必要であった。ヘリックスIIIの構造をNMRを用いて解析したところ、新たにA : C塩基対がSRP19の結合により、ドメインIIIが安定化していることがわかった。

Hay bacteria SRP は こ れ ま で の parsing か ら, 1 species の RNA (scRNA) と 2 kinds の protein (Ffh = 50 kda, HBsu = 10 kda) か ら constitute さ れ て お り, こ の う ち, HBsu は ホ モ ダ イ マ ー と し て combining し て い る. The combination of ずれ ずれ protein <e:1> and escherichia coli で で is を to construct た た. Improve the <s:1> result, crystal analysis に necessary とされる amount <e:1> ensure を obtain た. こ れ と す で に is の build が end し て い る Ffh タ ン パ ク quality, and び, test tube で planning write し た scRNA に よ り, then constitute a SRP の generated に successful し た が, crystal structure analytic に necessary な の ensure に は to っ て い な い. が こ れ は の highest working rate very low に い こ と と, シ ョ hook with much sugar density method such as で の reproducibility に problem が raw じ て い る. Intracellular で の SRP の contain quantity と raised colonization period と の masato is を parsing し た results, moral rights colonization period onwards に relative stability な SRP が す more く る こ と が Ming ら か と な っ た. The <s:1> <s:1> results を step まえ, subtilis mycelium よ を, direct and SRP particle <s:1> generation を test みた. そ の results, hay bacteria 100 リ ッ ト ル culture よ り, crystal structure analytic に necessary な ミ リ グ ラ ム 単 a の HBsu - Ffh - scmRNA complex が refined で き た. Now, the crystallization に asks the けた condition 検 for を rows って る る る. One party, ヒトSRP, 6 types of <s:1> タ パ パ パ pyrroid と1 type of pyrroid RNA らなる らなる(SRP RNA). All the に bases of SRP RNA らなるが and 300 base らなるが pair を to form a, characteristic な secondary structure を support. Functionally, らなると れら れら <s:1> construct れら 4ドメ される らなると らなると speculate される. 6 kinds の タ ン パ ク qualitative う ち, シ グ ナ ル know に masato directly with し, こ れ と combining す る SRP54 タ ン パ ク qualitative は SRP RNA の ド メ イ ン IV へ の combining に interstate し, SRP19 が don't の ド メ イ ン III に combining す る こ と が necessary で あ っ た. ヘ リ ッ ク ス III を NMR を の structure with い て parsing し た と こ ろ, new た に A: C salt base が seaborne SRP19 の combining に よ り, ド メ イ ン III が stabilization し て い る こ と が わ か っ た.

项目成果

Sakamoto, T.: "Solution structure of a SRSP19 binding domain in human SRP RNA"Journal of Biochemistry (Tokyo). 132・2. 177-182 (2002)

Sakamoto, T.：“人 SRP RNA 中 SRSP19 结合结构域的溶液结构”《生物化学杂志》（东京）132・2（2002 年）。

Ando, Y.: "Expression of a small RNA, BS203 RNA, from the yocI-yocJ intergenic region of Bacillus subtilis genome"FEMS Microbiology Letters. 207・1. 29-33 (2002)

Ando, Y.：“来自枯草芽孢杆菌基因组的 yocI-yocJ 基因间区域的小 RNA BS203 RNA 的表达”FEMS 微生物学快报 207・1（2002）。

Kumano, M: "Lincomycin resistance mutations in two regions immediately downstream of the-10 region of lmr promoter cause overexpression of a putative multidrug efflux pump in Bacillus subtilis mutants"Antimicrobial Agents and Chemotheraphy. 47・1. 432-435

Kumano, M：“紧邻 lmr 启动子 10 区域下游的两个区域的林可霉素抗性突变导致枯草芽孢杆菌突变体中假定的多药物外排泵的过度表达”抗菌剂和化疗 47·1。

Suzuma, S: "Identification and characterization of novel small RNAs in the aspS-yrvM intergenic region of the Bacillus subtilis genome"Microbiology. 148・8. 2591-2598 (2002)

Suzuma, S：“枯草芽孢杆菌基因组 aspS-yrvM 基因间区域中新型小 RNA 的鉴定和表征”微生物学 148・8（2002）。

Kakeshita, H.: "Effect of depletion of FtsY on spore morphology and the protein composition of the spore coat layer in Bacillus subtilis"FEMS Microbiol. Lett.. 195.1. 41-46 (2001)

Kakeshita, H.：“FtsY 耗尽对枯草芽孢杆菌孢子形态和孢子包衣层蛋白质组成的影响”FEMS Microbiol。