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イオンチャネル・受容体群の「膜上直接的相互作用」によるシナプス伝達の調節機構

离子通道与受体“直接膜相互作用”调节突触传递机制

基本信息

批准号：
16015238
负责人：
久保義弘
金额：
$ 3.84万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アフリカツメガエル卵母細胞にイオンチャネル型のATP受容体P2Xを発現させ、2本刺し膜電位固定下でATP投与後の電流を記録し、受容体の種々の性質を発現レベルとの関連において解析し以下の知見を得た。(1)チャネルポアのイオン選択性の指標であるP_<NMDG+>/P_<Na+>は発現密度と負の相関を示した。(2)内向き整流性の強弱は発現密度と負の相関を示した。(3)高濃度のATP(100uM)により弱い内向き整流性電流を呈する発現密度の高い細胞に、低濃度ATP(3uM)を投与するとその内向き整流性は増強した。(4)[ATP]-応答関係のKdの値は発現密度と負の相関を示した。(5)ポア上部の点変異1328Cにより上記の発現密度に依存したポアの性質の変化がほぼ消失した。以上の結果から「ATP投与により開状態に入った、ごく近傍にあるP2X_2受容体チャネル間の相互作用によりポア上部においてなんらかの構造変化が起こり、ポアの性質やリガンド感受性が変わる。」ことが想定された。さらに、P2X2受容体チャネルのリガンド投与による動的構造変化を、FRET法によりリアルタイムで解析することを目的として、C末端に蛍光蛋白CFPもしくはYFPを付加したコンストラクトを作成し、全反射照明下で膜に発現している分子由来の蛍光のみを測光した。実験当初、リガンド投与によりFRET値が変化するというデータを得ていたが、その後の解析により、CFPおよびYFPの両者が減少することが明らかになった。すなわち、C端部分が、リガンド投与によって、全反射照明の強度の弱い膜から離れた部位にシフトする可能性が示唆された。この点について、さまざまな部分に蛍光蛋白を付加したコンストラクトを作成し、さらに解析を進めている。

アフリカツメガエルOocyte にイオンチャネル type ATP receptor P2X を発appears させ、2 thorns しUnder fixed membrane potential After ATP administration, the current is recorded and the properties of the receptor are analyzed and the following knowledge is obtained. (1) The current density of the チャネルポアのイオン selection index is a negative correlation indicator. (2) The strength and weakness of the inward rectification is shown by the negative correlation between the density and the density of the inward rectification. (3) A high concentration of ATP (100uM) has a weak inward rectifying current and a high density of cells, while a low concentration of ATP (3uM) has a strong inward rectifying effect. (4) The [ATP]-response relationship is Kd and the current density is negative and the correlation is negative. (5) The upper part of the ポアのPoint difference 1328C により上记の発appears the densityにdepends and the nature の変化がほぼdisappearsした. The result of the above is the interaction between the ATP input and the open state of the ATP and the close proximity of the P2X_2 receptor.りポアupper part においてなんらかのstructural change が出こり、ポアの性やリガンドsensitivityが変わる」ことが思定された. Structural changes of the さらに, P2X2 receptor チャネルのリガンド and the による actionを、FRET method によりリアルタイムでanalytical purposeとして、C end Made with CFP, YFP, and CFPし、The film is exposed under total reflection illumination and the molecular origin is the photometric light. At the beginning, リガンド invested in によりFRETが変化するというデータを得ていたが,その后のanalytic により, CFP およびYFPの両者が reduce することが明らかになった.すなわち, C-end part が, リガンド cast and によって, total reflection illumination の intensity の weak い film かられた parts にシフトする possibility ががされた.この点について, さまざまなpart of に蛍光proteinをFUKAしたコンストラクトを成し, さらにanalytic を入めている.