ユビキチン関連蛋白質によるポリユビキチン鎖識別・運搬と仕分けの制御

通过泛素相关蛋白控制多聚泛素链识别、运输和分选

基本信息

批准号：
15032241
负责人：
小林英紀
金额：
$ 4.22万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeのDsk2は、N末端領域のユビキチン様配列(UbLドメイン)を介してプロテアソームと結合し、C末端領域のUBAドメインを介してポリユビキチン鎖と結合することにより、ポリユビキチン化した基質をプロテアソームへ輸送する機能を持つ。細胞内のDsk2の機能に関与する因子を同定するため、DSK2の過剰発現による生育阻止に対し耐性を示す変異株の分離を行い、sem1変異株を分離した。SEM1は、sec15-1のマルチコピーサプレッサーとして同定された、89アミノ酸からなる蛋白質をコードしている遺伝子である。SEM1破壊株由来の細胞抽出液を用いてイムノブロットを行ったところ、ポリユビキチン鎖の蓄積が見られた。SEM1破壊株においてプロテアソームの基質蛋白質の分解が遅れていた。次にプロテアソームのサブユニットの変異であるrpn1-821とsem1Δの2重変異株、及びpre2-75とsem1Δの2重変異株を作製したところ、制限温度が低下した。これらのことから、Sem1が生体内においてプロテアソームの機能に関与することが示唆された。また、26Sプロテアソームの免疫沈降を行ったところ、Sem1蛋白質が26Sプロテアソームの19Sサブユニットと共沈することが分かった。また、SEM1破壊株において、26Sプロテアソームが不安定になることが明らかとなった。以前より報告されていた、19Sサブユニットの安定性に関与するサブユニットRPN10は、SEM1と遺伝学的相互作用を示し、rpn10Δsem1Δ二重破壊株は制限温度の低下を引き起こした。またこの二重破壊株由来の26Sプロテアソームはsem1Δ株よりもさらに不安定であることが明らかとなった。以上のことから、Sem1はプロテアソームの安定性に寄与するプロテアソームの19S RPの構成因子であることが示唆された。

酿酒酵母的发芽酵母菌的DSK2的功能是通过N-末端区域中的泛素样序列（UBL结构域）将多泛素化的底物运输到蛋白酶体中，并通过C-末端区域的UBA结构域与多泛素链结合。为了鉴定DSK2在细胞中涉及的因素，分离了对DSK2过表达引起的生长抑制的突变体，并分离了SEM1突变体菌株。 SEM1是一种编码由89个氨基酸组成的蛋白质的基因，被鉴定为SEC15-1的多拷贝抑制剂。当使用源自SEM1破坏菌株的细胞提取物时，观察到聚泛素链的积累。蛋白酶体的底物蛋白的降解延迟在SEM1中断菌株中。接下来，准备了RPN1-821和SEM1δ的双重突变体，它们是蛋白酶体亚基中的突变，并且制备了PRE2-75和SEM1δ的双突变体，并降低了限制温度。这些结果表明SEM1参与体内蛋白酶体的功能。此外，对26S蛋白酶体的免疫沉淀显示，SEM1蛋白与26S蛋白酶体的19S亚基共沉淀。还揭示了26S蛋白酶体在SEM1破坏菌株中变得不稳定。先前报道的涉及19S亚基稳定性的亚基RPN10与SEM1表现出遗传相互作用，RPN10ΔSEM1Δ双层菌株导致限制温度降低。还揭示了从该双重破坏性应变衍生的26S蛋白酶体比SEM1δ菌株更不稳定。以上表明SEM1是蛋白酶体19S RP的组成因子，这有助于蛋白酶体的稳定性。