単クローン抗体を用いる壁細胞膜受容体並びに膜機能蛋白質の同定と解析

家兎胃粘膜を遠心分画法を用いて細胞下分画し、さらにマイクロソーム画分を密度勾配超遠心法により細分画し、酸分泌を担う膜酵素本体と考えられるH^+、K^+-ATPaseを粗画分に比較して50倍以上に純化精製した。この膜画分にはH^+、K^+-ATPaseが膜蛋白質の約30%の割合で含まれていることが、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって確認されている。そこでこの膜画分を抗原としてBALB/cマウスに免疫し、その脾細胞をマウスミエローマ細胞に常法に従って融合させ、HAT培地でハイブリドーマを選択し、さらにそのなかで抗体産生能を有するものを酵素免疫測定法によって選択し、限界希釈法によって抗体産生クローンを選別した。この過程で16種類のクローンが得られたが、増殖能、免疫組織学的検索を満足させるものはこのうち5種類に限定された。これらの単クローン抗体はいずれも免疫組織学的に家兎壁細胞を特異的に染色することができた。しかしImmunoblot法ではいずれの抗体もH^+、K^+-ATPaseに相当する蛋白を含めすべての膜構成蛋白を認識せず、免疫沈降法でも反応する蛋白が得られなかった。またH^+、K^+-ATPase活性にも特に影響が認められなかった。このことから今回得られたモノクローナル抗体の組織特異性は、組織における複合体からなる高次構造の認識によるものではないかと考えられた。従って、これらの抗体は組織あるいは細胞レベルでの壁細胞の同定には有用であるものの、ある特定の膜蛋白の機能的役割や代謝を検討するうえでは必ずしも適当とはいえず、今後同様の手法を用いて特定の膜蛋白を認識する単クローン抗体の作成を行う予定である。

家兎胃粘膜を遠心分画法を用いて細胞下分画し、さらにマイクロソーム画分を密度勾配超遠心法により細分画し、酸分泌を担う膜酵素本体と考えられるH^+、K^+-ATPaseを粗画分に比較して50倍以上に純化精製した。この膜画分にはH^+、K^+-ATPaseが膜蛋白質の約30%の割合で含まれていることが、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって確認されている。そこでこの膜画分を抗原としてBALB/cマウスに免疫し、その脾細胞をマウスミエローマ細胞に常法に従って融合させ、HAT培地でハイブリドーマを選択し、さらにそのなかで抗体産生能を有するものを酵素免疫測定法によって選択し、限界希釈法によって抗体産生クローンを選別した。この過程で16種類のクローンが得られたが、増殖能、免疫組織学的検索を満足させるものはこのうち5種類に限定された。これらの単クローン抗体はいずれも免疫組織学的に家兎壁細胞を特異的に染色することができた。しかしImmunoblot法ではいずれの抗体もH^+、K^+-ATPaseに相当する蛋白を含めすべての膜構成蛋白を認識せず、免疫沈降法でも反応する蛋白が得られなかった。またH^+、K^+-ATPase活性にも特に影響が認められなかった。このことから今回得られたモノクローナル抗体の組織特異性は、組織における複合体からなる高次構造の認識によるものではないかと考えられた。従って、これらの抗体は組織あるいは細胞レベルでの壁細胞の同定には有用であるものの、ある特定の膜蛋白の機能的役割や代謝を検討するうえでは必ずしも適当とはいえず、今後同様の手法を用いて特定の膜蛋白を認識する単クローン抗体の作成を行う予定である。