間葉系幹細胞から骨芽細胞分化が選別されるメカニズムの解明

阐明从间充质干细胞中选择成骨细胞分化的机制

• 批准号: 17689041
• 负责人: 前田 真吾
• 金额: $ 17.47万
• 依托单位: Japanese Foundation For Cancer Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17689041/
• 关键词: 間葉系前駆細胞; Osterix; 骨芽細胞分化; 分化選別; オステリクス; 軟骨細胞分化; 脂肪細胞分化

骨芽細胞分化選別因子の候補遺伝子Osterixのレンチウイルスによるノックダウン実験を行った。アデノウイルスによる過剰発現系で見られた軟骨細胞分化や脂肪細胞分化の抑制の逆、すなわち促進を期待した訳であるが、予想に反してOsterixのloss of functionはin vitroでは何の変化も示さなかった。これはOsterixのノックアウトマウスの内軟骨性骨化に伴う現象から得られた考察に基づく仮説なので、in vitroではうまく環境を再現出来ていない可能性がある。下記標的遺伝子が決定したら遺伝子改変マウスを作製したい。Osterixの間接作用、特にOsterixが誘導する骨特異的de novo遺伝子の検索に入った。OsterixのアデノウイルスをBMP作用の有無でそれぞれmMSCとC3H10T1/2細胞に感染させてマイクロアレイを施行した。BMPが主に骨芽細胞分化を促進するmMSCと、BMPによって軟骨分化が進むが、Osterix感染によって骨芽細胞分化にshiftするC3H10T1/2を比較した。特にC3H10T1/2での動きが大事で、BMP単独(軟骨分化環境)では発現がmMSCのBMP添加群と比べて低く、Osterixを入れて初めて上がる遺伝子に注目した。Osterixの下流である目的遺伝子は、Osterixの上流であるRunx2によっても間接的に誘導されるはずであるから、Runx2のアデノウイルスの感染も行った。その結果、約45,000 probe setsの中から19遺伝子が残った。さらにこの中で骨芽細胞に発現が限局されるものを探した。なぜならば、Osterixは骨芽細胞にしか発現しないからである。その結果、3つの遺伝子がスクリーニングをパスした。現在これらの発現ベクターの作製からウイルスまで完成しており、機能解析を間葉系細胞で開始している。

使用Osterix（用于成骨细胞分化分选因子的候选基因）的慢病毒进行了敲低实验。预计这将成员促进抑制腺病毒在过表达系统中看到的软骨细胞分化和脂肪细胞分化的抑制，但与预期相反，Osterix的功能丧失在体外没有变化。这是一个基于从与Osterix基因敲除小鼠的骨化相关的现象获得的考虑因素的假设，因此可能无法在体外很好地再现环境。一旦确定了下面的靶基因，我们希望产生遗传修饰的小鼠。我们搜索了Osterix的间接影响，尤其是Osterix诱导的骨特异性DE基因。具有或不具有BMP作用的C3H10T1/2细胞感染了Osterix腺病毒，并进行了微阵列。我们比较了MMSC，其中BMP促进成骨细胞分化，并与C3H10T1/2进行了比较，该分化促进了由于卵巢感染而引起的软骨分化，但转移到成骨细胞分化。 C3H10T1/2处的运动尤为重要，仅BMP中的表达（软骨分化环境）低于BMP添加组中MMSC的表达，我们专注于仅在添加Osterix时增加的基因。 Osterix下游的靶基因也应由Osterix上游的Runx2间接诱导，因此也进行了Runx2腺病毒感染。结果，大约45,000个探针组保留了19个基因。此外，我们搜索了一个在成骨细胞中表达有限的组。这是因为Osterix仅在成骨细胞中表达。结果，三个基因通过了筛选。目前，从这些表达载体的制备到病毒的所有事物都是完整的，并且在间充质细胞中开始功能分析。