強皮症におけるトポイソメラーゼIに対する自己免疫応答とその病態との関連の解析

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強皮症は、全身性の皮膚硬化に加え、内蔵病変を呈する全身性の自己免疫疾患であり、その成因は不明である。強皮症では、DNA複製転写に関わる重要な核内抗原であるトポイソメラーゼI(トポI)に対する自己抗体が特徴的である。このトポIに対する自己免疫応答を誘導できる動物モデルを作成し、トポIに対する応答と強皮症の関連を解析することを目的とした。しかし、一般的にトポIのように全身性に発現されていて、免疫学的寛容が成立している自己抗原に対する免疫応答を誘導することは困難である。そこで、まず全身性の自己抗原に対する免疫応答を誘導する方法として、トポIと同じく全身性に発現し自己免疫疾患にて自己抗体の標的であるU1RNP-A蛋白を用いて、樹状細胞とDNA免疫という二つの方法を試みた。DNA免疫法ではマウスU1-AcDNAをくみこんだ発現プラスミドをマウス大腿に注射した。樹状細胞免疫法ではマウス骨髄よりGM-CSFとIL-4を用いて誘導した樹状細胞にリコンビナントマウスU1-Aを負荷し、マウスに静脈注射した。いずれも方法でもU1-Aに対する自己抗体とT細胞応答とを誘導できることが判明した。続いて同じ戦略を、トポIに対して適用した。まずマウストポIcDNAクローニングを行った。トポIN末側部分cDNAをPCRにてクローニングし、これを創価大学工学部安藤俊夫教授より供与されたC末側cDNAと連結し全長cDNAを得た。このcDNAを用いて、抗トポI抗体陽性患者血清を大腸菌で発現したリコンビナント蛋白は不溶性でかつ蛋白分解産物が多かった。そこでバキュロウィルス発現系を用いて可溶性全長蛋白の発現に成功した。ヘパリンカラムとゲル濾過にてこの蛋白を精製し、実際にトポI活性を持つことを確認することができた。cDNA及びリコンビナント抗原を獲得したので、自己免疫応答の誘導に着手可能となった。