ディファレンシアル・ディスプレイ法による転座関連キメラmRNAの役割の解析

使用差异显示法分析易位相关嵌合mRNA的作用

基本信息

批准号：
09877143
负责人：
林泰秀
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

11q23転座のt(11;22)とt(10;11)のキメラmRNAよりcDNAを作成し、マウスIL3依存性骨髄性細胞株LG細胞に導入してトランスフェクタントを作ることを考え、11q23転座のMLL遺伝子を用いて、t(11;22)(q23;q13)がMLL-p300、またt(10;11)はMLL-ABI-1キメラcDNAから作成されていることを明らかにし(Blood 92:1125,1998)、この全長のキメラcDNAを作成することから始めた。患者白血病細胞よりRNAを抽出し、cDNAを合成し、reverse transcriptase(RT)-PCR法により切断点を含む約4kbと2.5kbのMLL-p300とMLL-ABI-1キメラcDNAをクローニングした。最近ヒトp300のcDNAが単離されたので、切断点を含む約7kbの3′側のCBPのcDNAを供与していただき、やはり供与していただいたエクソン7までを含む5′側MLLcDNAと、クローニングしたMLL-p300キメラcDNAおよび3′側CBPcDNAをつなぎ、約10kbの全長のMLL-p300キメラcDNAを作成した。現在このキメラcDNAをレトロウイルスベクターに組み込みリン酸カルシウム法を用いてマウスのLG細胞への導入を行っており、MLL-p300キメラ蛋白を発現した細胞が得られた場合、今後、細胞の増殖速度の変化および分化傾向の有無を導入前の細胞と比較し、その性状を検索する。また導入前と後の細胞からそれぞれRNAを抽出し、これらよりcDNAを作成してdifferential display用のプライマーセット20組を用いてPCRで増幅し、両者のバンドの増減を検索し、MLL-p300キメラ蛋白によって誘導される遺伝子の単離を試みている。さらにrepresentative differential assayにても同様の検討を行っている。

我们首先是从11q23易位的t（11; 22）和t（10; 11）的嵌合mRNA创建cDNA，然后将它们引入LG细胞中，这是小鼠IL3依赖性的髓样细胞系以创建转染剂。使用MLL基因在11 Q23易位时，我们透露T（11; 22）（Q23; Q13）是由MLL-P300创建的，由MLL-ABI-1嵌合cDNA（血液92：1125，1998）创建T（10; 11），并通过创建这个全长的壳聚糖cDNA。从患者白血病细胞中提取RNA，合成cDNA，并通过逆转录酶（RT）-PCR克隆了约4 kb和2.5 kb的MLL-P300，MLL-ABI-1-1嵌合cDNA被克隆。由于最近分离了人类p300 cDNA，因此我们收到了一个约7 kb的3'CBP cDNA，其中包含该断点，我们连接了5'MLL cDNA，该5'MLL cDNA包含到外显子7（也捐赠），也捐赠了，它也与克隆的MLL-P300嵌合CDNA和3'CBP CDNA连接起来，以创建全长MLL-P300 CDNA，大约10 KB。当前，该嵌合cDNA被掺入逆转录病毒载体中，并使用磷酸钙方法将其转移到小鼠LG细胞中，如果获得表达MLL-P300嵌合蛋白的细胞，则将在引入其属性之前将其与细胞进行比较之前将细胞的增殖速率以及与细胞区分开的趋势与细胞进行比较。在引入前后，从细胞中提取RNA，从这些cDNA中从细胞中提取，并使用20组用于差分显示的引物组进行放大，以寻找两者的频带的增加或减小，并试图隔离MLL-P300奇马氏蛋白诱导的基因。此外，对代表性差异评估也在进行类似的考虑。