In vivo RNAiによる遺伝子ノックダウンマウス作出と薬物動態研究への応用

通过体内RNAi创建基因敲除小鼠及其在药代动力学研究中的应用

• 批准号: 15659036
• 负责人: 高倉 喜信
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15659036/
• 关键词: RNA干渉; 遺伝子ノックダウン; トランスポーター; P-Glycoprotein; siRNA; siRNA発現ベクター; ハイドロダイナミクス法; in vivo; ルシフェラーゼ; in vitro; p-糖タンパク

2本鎖RNAを用いた特定遺伝子の発現抑制は、RNA干渉(RNA interference:以下RNAi)と呼ばれるが、線虫において最初に報告され、効率よく配列特異的な遺伝子のノックダウンが可能であることが示された。その後、改良法の適用によりRNAiの誘導が培養哺乳類細胞においても可能であることが発見され、極めて有用性の高い遺伝子機能解析ツールとしてにわかに注目を集めている。本研究は、RNAiをマウス個体レベルで実現する方法を確立し、薬物動態を支配する重要な機能分子であるトランスポーターや薬物代謝酵素の遺伝子をin vivoでノックダウンしたマウスの作出を目指す。昨年度はホタルルシフェラーゼを外来のモデル標的遺伝子に選択してRNAiの評価を行ない、マウスの系において水溶液の形で高容量(1.6ml/mouse)、高速(5秒以内)で静脈内投与するハイドロダイナミクス法を利用することで、in vivoで外来遺伝子のノックダウンが可能であることを明らかにした。そこで本年度は、内因性の標的遺伝子標的として肝実質細胞に発現している薬物排出トランスポーターP-Glycoprotein (P-gp)を選択し、標的塩基配列に相補的な合成の短い二本鎖RNA(siRNA)およびsiRNA発現プラスミドベクターを設計した。これらをマウス静脈内にハイドロダイナミクス法により投与した結果、mRNAレベルが有意に低下することが明らかとなった。また、ウエスタンブロッティングによるタンパクレベルでの評価においても低下していることが示され、in vivoにおける内因性の標的遺伝子をノックダウンできる可能性が示唆された。

2 this RNA uses a specific sub-report to show suppression, a RNA trunk (RNA interference: the following RNAi), a bug to initially report a report, and a special sub-report to show that the rate is specific. Since then, the improved method has been used to guide the cultivation of mammalian cells. It is possible to improve the quality of information and usefulness. The sub-machine will be able to analyze the information of mammalian cells. In this study, RNAi laboratory experiments show that the methods are established, and the physical dynamics control the important mechanical molecules. The enzymes are substituted by the enzymes, the in vivo enzymes, and the target instructions are made. For the first time in the year of last year, the sub-selection of foreign equipment was selected: RNAi, aqueous solution, high-capacity (1.6ml/mouse), high-speed (less than 5 seconds), static infusion (ICI) and high-speed (less than 5 seconds). It is possible that the in vivo may not be able to find out if there is a problem. In the current year, in the case of the children of the internal cause of the disease, it was found that the equipment was excreted. The P-Glycoprotein (P-gp) was selected, and the base configuration of the product was selected. This is the synthesis of the short-term RNA (siRNA) software siRNA. This is a good example of how to design the system. Do you want to know if you want to know if you are going to have a problem with the results of the mRNA test? please do not know what to do. Please tell me that the possibility is abetted by the fact that it is possible to show that there is an internal cause of the disease, and that the possibility is instigated by the in vivo.

项目成果

Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane : inplication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery

基于流体动力学的程序涉及肝细胞膜的瞬时高渗透性：有效细胞内基因传递中非特异性过程的暗示

• 发表时间: 2004
• 期刊: Journal of Gene Medicine 6(5)
• 作者: Naoki Kobayashi et al.

Naoki Kobayashi et al.: "Vector-Based in vivo RNA Interference : Dose-and Time-Dependent Suppression of transgene Expression"Journal of Pharmacology and Experimantal Therapeutus. 308(2). 688-693 (2004)

Naoki Kobayashi 等人：“基于载体的体内 RNA 干扰：转基因表达的剂量和时间依赖性抑制”药理学和实验治疗杂志。

Hepatic delivery of particulates in the submicron range by a hydrodynamics‐based procedure: implications for particulate gene delivery systems

• DOI: 10.1002/jgm.531
• 发表时间: 2004-04
• 期刊: The Journal of Gene Medicine
• 作者: Naoki Kobayashi;Kazuhiro Hirata;Shi Chen;Atsushi Kawase;M. Nishikawa;Y. Takakura