哺乳動物細胞の形質発現を制御する光スイッチングシステムの開発

开发控制哺乳动物细胞表达的光学开关系统

• 批准号: 15650097
• 负责人: 稲葉 俊哉
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15650097/
• 关键词: 光応答; 生体スイッチ; phytochromeB

光(可視光)によってヒト細胞内で機能する生体スイッチの開発を試みた。人工臓器作成の過程で形態を整える必要が生じた際に、過剰となった細胞にアポトーシスを誘導するため、レーザー光による集積回路(LSI)作成技術の応用が可能ではないかと考えたのが発端である。すなわち哺乳類の細胞に光を当ててシグナルを送り、細胞内反応を惹起するシステムを開発する。光受容体システムとしては植物細胞のPhytochromeB(PhyB)/PIF3システムの応用を考えた。植物細胞ではPhyBは発色団であるphytochromobilin(PCB)と結合し、細胞質内に限局する。赤色光の照射によるPCBの立体構造変化を通じてPhyBは核内に移行し、転写因子PIF3と結合する。このシステムを動物細胞内でも機能させるために、PhyBのPCB結合ドメインと哺乳類細胞で機能する転写因子との融合蛋白質(キメラ)を作成してヒト細胞内に発現させる。また動物細胞ではPCBを合成る酵素を欠くため、PCBを細胞外から取り込ませる。通常の状態では細胞質にあって不活性である転写因子を赤色光照射によって核内に移行させることにより転写のスイッチを入れることが可能となる。本研究では転写因子としてテトラサイクリンによる遺伝子誘導発現系で用いられる転写因子を用い、クラゲの緑色色素蛋白GFPを発現させる系で検証した。PCBはリポフェクチン法で細胞内に導入した。一過性発現および永久発現の系においてキメラ転写因子は細胞質内に分布し、赤色光照射によって核内に移行した。それに伴ってGFPの誘導発現を見たことから、研究の目的は達成された。実用化に向けて発現効率の改善と、現在高価な試薬を用いているPCBの導入法の改善が今後の研究の課題である。

我们试图开发一种生物开关，该开关通过光（可见光）在人类细胞中起作用。当有必要调整人造器官生产过程中的形态时，人们认为可以应用激光基综合电路（LSI）生产技术来诱导过量细胞的凋亡。换句话说，开发了一个系统，该系统发出淡淡的哺乳动物细胞以发送信号并诱导细胞内反应。我们已经将植物色素B（Phyb）/PIF3系统应用于植物细胞中作为感光体系统。在植物细胞中，PHYB与发色团植物绿ob（PCB）结合，并位于细胞质中。 PHYB由于红光照射而通过PCB中的构象变化转移到核中，并与转录因子PIF3结合。为了使该系统在动物细胞中起作用，在人类细胞中创建并表达了PHYB的PCB结合域的融合蛋白（嵌合体），并在哺乳动物细胞中发挥了转录因子的作用。此外，由于动物细胞缺乏合成PCB的酶，因此从外部取下PCB。在正常状态和细胞质中无活性的转录因子可以通过照射红光转移到细胞核中。在这项研究中，我们使用了使用四环素作为转录因子中使用的基因诱导表达系统中使用的转录因子，并在表达水母的绿色色素蛋白GFP的系统中对其进行了测试。使用LipoFectin将PCB引入细胞中。在瞬态和永久表达系统中，嵌合转录因子分布在细胞质中，并通过红光照射将其转移到核中。随后是GFP的诱导表达，该表达实现了研究的目的。未来研究的挑战是提高表达效率，以准备实际使用和改善PCB的引入方法，PCB目前使用昂贵的试剂。

项目成果

Akiyama T.: "Regulation of osteoclast apoptosis by ubiqutination of proapoptotic BH3-only Bcl-2 family member Bim."EMBO J.. in press.

Akiyama T.：“通过促凋亡 BH3-only Bcl-2 家族成员 Bim 泛素化调节破骨细胞凋亡。”EMBO J.. 正在出版。