発生異常の分子機構のジーントラッピング法による解析

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ジーントラップ用ベクターを作製した。これは、レポーター遺伝子としてプロモーターをもたないLacZ遺伝子、選択マーカーとしてAc-neo遺伝子、染色体から再回収するためのマーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子とSupF遺伝子を含む。ES-MSI細胞を用いた予備実験では、600個のG418耐性クローン中、80個がX-gal染色陽性であった。さらにこのうち6クローンから、5'側隣接領域の回収を試みたところ、ベクターが複数挿入していた1例を除き容易に回収できた。またこのプラスミドをF9細胞に導入すると、4例でレポーター遺伝子が発現した。すなわち、レポーターの発現したトラップベクターは高率にプロモーターの直下に挿入してした。これらの中からES細胞の分化に伴い速やかにレポーターの発現が消失するクローンについて回収した領域を解析し、分化誘導に反応する最小領域を決定して塩基配列を調べたところ、典型的なオクタマー結合配列が2つ認められた。さらにゲルシフトほうによる解析の結果から、このプロモーターはOct-3の標的遺伝子の1つであると考えている。また、クローンからはキルラマウスができなかったので、回収したプラスミドを用いてトランスジェニックマウスを作製して、レポーターの発現パターンの解析を行った。このマウスの成体組織で、後頭葉の大脳皮質の限定された神経細胞と十二指腸の神経節細胞においてレポーターの発現を検出した。ES-D3細胞に用いて同様の実験を行った。ES細胞でレポーターの発現をみた14クローンのうち、12クローンからキメラマウスが得られ、このうち9クローンのキメラマウスからは、ES細胞由来のトラップベクターをヘテロにもつ個体が得られた。現在、胎生期におけるレポーターの発現パターンとホモ個体における表現型の解析を進めている。