RhoのターゲットとしてのCD44ERM-アクチンシステム

低分子量GTP結合蛋白質のうち、rhoは、細胞接着やストレスファイバー/分裂溝の形成に関わっていることから、アクチンフィラメントと細胞膜の結合部位がそのターゲットではないかと推測されている。しかし、アクチンフィラメントと細胞膜の結合部位の基本的な分子構築に関する我々の理解が浅かったために、rhoのアクチン系への作用メカニズムに関しては解析がなかなか進まなかった。我々は、アクチンフィラメントと細胞膜の結合のための基本ユニットとして、上述のCD44-ERM-アクチンシステムを同定し、そこにrhoGDIが存在する事を見いだした。したがって、このシステムがrhoの直接のターゲットとなっている可能性が高い。本研究は、CD44とERMの結合およびERMとアクチンの結合にrhoがどのような影響を及ぼすかについてin vivoとin vitroの両面からアプローチした。作業仮説としては、CD44とERMの結合、または、ERMとアクチンフィラメントの結合が、rhoによって制御されていると考えた。このことを証明するためには、まず、in vitroでこれらの結合を測定できるシステムを構築する事が必要である。そのために:(1)エズリン、ラディキシン、モエシンをそれぞれバキュロウイルスの系を用いて、大量発現させ、精製した。(2)CD44の細胞質領域とGSTの融合蛋白質を大腸菌で作らせた。(3)グルタチオンカラムを用いて、GST-CD44とリコンビナントERMとの結合を測定する系を構築した。(4)アクチンフィラメントとリコンビナントERMとの結合を、やはり、in vitroで検出する系を確立した。このようにして確立したCD44とERM、およびERMとアクチンフィラメントの結合のアッセイ系を用いて、これらの結合に対するrhoの影響を調べた。(1)rhoとしては、大阪大学高井義美教授から頂いたリコンビナントを用いた。(2)rhoをGTP-γS、およびGDP存在下で、上記のアッセイ系に加え、GTPの状態によってrhoの影響に変化があるかを調べた。

低分子量GTP結合蛋白質のうち、rhoは、細胞接着やストレスファイバー/分裂溝の形成に関わっていることから、アクチンフィラメントと細胞膜の結合部位がそのターゲットではないかと推測されている。しかし、アクチンフィラメントと細胞膜の結合部位の基本的な分子構築に関する我々の理解が浅かったために、rhoのアクチン系への作用メカニズムに関しては解析がなかなか進まなかった。我々は、アクチンフィラメントと細胞膜の結合のための基本ユニットとして、上述のCD44-ERM-アクチンシステムを同定し、そこにrhoGDIが存在する事を見いだした。したがって、このシステムがrhoの直接のターゲットとなっている可能性が高い。本研究は、CD44とERMの結合およびERMとアクチンの結合にrhoがどのような影響を及ぼすかについてin vivoとin vitroの両面からアプローチした。作業仮説としては、CD44とERMの結合、または、ERMとアクチンフィラメントの結合が、rhoによって制御されていると考えた。このことを証明するためには、まず、in vitroでこれらの結合を測定できるシステムを構築する事が必要である。そのために:(1)エズリン、ラディキシン、モエシンをそれぞれバキュロウイルスの系を用いて、大量発現させ、精製した。(2)CD44の細胞質領域とGSTの融合蛋白質を大腸菌で作らせた。(3)グルタチオンカラムを用いて、GST-CD44とリコンビナントERMとの結合を測定する系を構築した。(4)アクチンフィラメントとリコンビナントERMとの結合を、やはり、in vitroで検出する系を確立した。このようにして確立したCD44とERM、およびERMとアクチンフィラメントの結合のアッセイ系を用いて、これらの結合に対するrhoの影響を調べた。(1)rhoとしては、大阪大学高井義美教授から頂いたリコンビナントを用いた。(2)rhoをGTP-γS、およびGDP存在下で、上記のアッセイ系に加え、GTPの状態によってrhoの影響に変化があるかを調べた。