RhoのターゲットとしてのCD44ERM-アクチンシステム

CD44ERM-肌动蛋白系统作为 Rho 的靶标

• 批准号: 07256208
• 负责人: 月田 早智子
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07256208/
• 关键词: rho; 細胞接着; アクチン; CD44; ERM; rhoGDI; GTP-γS; ラディキシン

低分子量GTP結合蛋白質のうち、rhoは、細胞接着やストレスファイバー/分裂溝の形成に関わっていることから、アクチンフィラメントと細胞膜の結合部位がそのターゲットではないかと推測されている。しかし、アクチンフィラメントと細胞膜の結合部位の基本的な分子構築に関する我々の理解が浅かったために、rhoのアクチン系への作用メカニズムに関しては解析がなかなか進まなかった。我々は、アクチンフィラメントと細胞膜の結合のための基本ユニットとして、上述のCD44-ERM-アクチンシステムを同定し、そこにrhoGDIが存在する事を見いだした。したがって、このシステムがrhoの直接のターゲットとなっている可能性が高い。本研究は、CD44とERMの結合およびERMとアクチンの結合にrhoがどのような影響を及ぼすかについてin vivoとin vitroの両面からアプローチした。作業仮説としては、CD44とERMの結合、または、ERMとアクチンフィラメントの結合が、rhoによって制御されていると考えた。このことを証明するためには、まず、in vitroでこれらの結合を測定できるシステムを構築する事が必要である。そのために:(1)エズリン、ラディキシン、モエシンをそれぞれバキュロウイルスの系を用いて、大量発現させ、精製した。(2)CD44の細胞質領域とGSTの融合蛋白質を大腸菌で作らせた。(3)グルタチオンカラムを用いて、GST-CD44とリコンビナントERMとの結合を測定する系を構築した。(4)アクチンフィラメントとリコンビナントERMとの結合を、やはり、in vitroで検出する系を確立した。このようにして確立したCD44とERM、およびERMとアクチンフィラメントの結合のアッセイ系を用いて、これらの結合に対するrhoの影響を調べた。(1)rhoとしては、大阪大学高井義美教授から頂いたリコンビナントを用いた。(2)rhoをGTP-γS、およびGDP存在下で、上記のアッセイ系に加え、GTPの状態によってrhoの影響に変化があるかを調べた。

Low molecular weight GTP binding protein made の う ち, rho は, cells then や ス ト レ ス フ ァ イ バ ー divide/ditch の form に masato わ っ て い る こ と か ら, ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト と membrane の combining site が そ の タ ー ゲ ッ ト で は な い か と speculation さ れ て い る. し か し, ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト と membrane の combining site の basic molecular building に な masato す る 々 I understand の が shallow か っ た た め に, rho の ア ク チ ン department へ の role メ カ ニ ズ ム に masato し て は parsing が な か な か into ま な か っ た. I 々 は, ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト と の combined with cell membrane の た め の basic ユ ニ ッ ト と し て, the above の CD44 - ERM - ア ク チ ン シ ス テ ム を with し, そ こ に rhoGDI が exist す る things を see い だ し た. The possibility of たがって たがって, <s:1> システムが システムがrho システムが being directly <s:1> タ ゲットとなって る る る is が high <e:1>. This study は, CD44 と ERM の combining お よ び ERM と ア ク チ ン の combining に rho が ど の よ う な influence を and ぼ す か に つ い て in vivo と in vitro の struck surface か ら ア プ ロ ー チ し た. Homework 仮 said と し て は, CD44 と ERM の combination, ま た は, ERM と ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト の が, rho に よ っ て suppression さ れ て い る と exam え た. こ の こ と を prove す る た め に は, ま ず, the in vitro で こ れ ら の で combination with the determination of the を き る シ ス テ ム を build す が る things necessary で あ る. そ の た め に : (1) エ ズ リ ン, ラ デ ィ キ シ ン, モ エ シ ン を そ れ ぞ れ バ キ ュ ロ ウ イ ル ス の is を with い て, massive 発 now さ せ, refined し た. (2)CD44 <s:1> cytoplasmic domain とGST <s:1> fusion protein を escherichia coli で らせた. (3) グ ル タ チ オ ン カ ラ ム を with い て, GST - CD44 と リ コ ン ビ ナ ン ト ERM と の す combination with the determination of the を る department を build し た. (4) ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト と リ コ ン ビ ナ ン ト ERM と の を, や は り, the in vitro で 検 out す を る department establish し た. こ の よ う に し て establish し た CD44 と ERM, お よ び ERM と ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト の combining の ア ッ セ を イ department with い て, こ れ ら の combining に す seaborne る rho の influence を adjustable べ た. (1)rhoと て て た, Professor Yoshimi takai of Osaka university ら ら, たリコ たリコ ビナ トを トを トを た た. (2) the rho を GTP - gamma S, made お よ び で, written in the presence of GDP の ア ッ セ イ に plus え, GTP の state made に よ っ て rho の influence に variations change が あ る か を adjustable べ た.

项目成果

Sagara, J. et al.: "Cellular actin-binding ezrin-radixin-moesin (ERM) family proteins are incorporated into the rabies virion and closely associated with viral envelope proteins in the cell" Virology. 206. 485-494 (1995)

Sagara, J. 等人：“细胞肌动蛋白结合 ezrin-radixin-moesin (ERM) 家族蛋白被整合到狂犬病病毒粒子中，并与细胞中的病毒包膜蛋白密切相关”病毒学。

Takeda, H. et. al.: "V-src kinase shifts the cadherin-based cell adhesion from the strong to the weak state and beta-catenin is not required for the shift." Journal of Cell Biology. 131. 1839-1847 (1995)

武田，H.等。

Hirao, M. et. al.: "Phosphoinositide-dependent association of ERM proteins with the cytoplasmic domain of CD44 in vitro" Journal of Cell Biology. (in press). (1996)

平尾，M.等。

Takahashi, K. et. al.: "Translocation of activated Rho from the cytoplasm to membrane rufflong area, cell-cell adhesion sites, and cleavage furrows" Oncogene. 11. 39-48 (1995)

高桥，K.等。

Tsukita, Sa et. al.: "The small GDP-binding protein rho regulates the formation of the CD44-ERM complex associated with rho-GDI" Journal of Cell Biology. (in press). (1996)

Tsukita，Sa 等。