温度変異p53遺伝子を持つマウス赤白血病細胞の生物特性

p53基因温度突变小鼠红白血病细胞的生物学特性

• 批准号: 07273221
• 负责人: 井川 洋二
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07273221/
• 关键词: 温度感受性p53; 赤白血病細胞; アポトーシス; FragmentA 結合蛋白; 分化誘導

フレンドウイルスgp55遺伝子導入トランスジェニックマウス由来の赤白血病細胞系より温度感受性変異p53(p53^<val-135>)遺伝子を発現する赤白血病細胞株(1-2-3)を樹立した。同細胞株では変異p53は細胞質に局在するが、温度シフトにより野生型p53の発現を誘導するとp53は核内に移行し標的DNAに結合する。即ち、1-2-3細胞を37℃、あるいは32℃で培養した後、抗p53モノクローナル抗体(PAb421)を用いて免疫染色を行った。37℃では細胞質が、32℃では核が染色された。更に、p53結合性DNA配列を有するFragmentAをプローブとしてゲルシフト解析を行った。32℃で培養した細胞の核抽出物中にはFragmentA-蛋白質複合体が検出されたが、37℃では検出されなかった。このことから、野生型p53のみがFragmentAに結合することが明らかとなった。さらに、野生型p53の発現に伴いこの赤白血病細胞系の細胞増殖能が顕著に低下し、アポトーシスが誘導されることを明らかにした。即ち、1-2-3細胞を37℃、あるいは32℃で培養し細胞増殖速度を解析した。32℃では、著しく細胞増殖速度が低下した。また、細胞よりDNAを抽出し1.5%アガロースゲルで電気泳動し解析したところ、32℃で培養した場合アポトーシスに特徴的な染色体DNAの断片化が観察された。またこの時、細胞周期制御に関与するp21、gadd45、およびcyclin Gの発現は活性化されるが、アポトーシス関連遺伝子bcl-2、bax、fas、およびfas ligandの発現上昇は認められないことを見出した。p53遺伝子変異により細胞周期制御に関与する遺伝子の機能が抑制され、細胞の腫瘍性が維持される可能性が示唆された。更に、温度シフトにより野生型p53を発現させるとp53は核内に移行し、その細胞質内局在にはheat-shock cognate protein 70(HSC70)が関与する可能性が考えられたが、cycloheximideで処理すると、変異型p53はHSC70と結合しているにも関わらず核内へ移行するので、細胞質内局在には他の因子の介在が予測される。

A leukemic cell <val-135>line (1-2-3) from which the temperature-sensitive variant p53(p53^ ) gene was developed was established. Different p53 in the same cell line can be induced by cytoplasmic changes, temperature changes, induction of wild-type p53, migration of p53 into the nucleus, and binding of target DNA. 1-2-3 cells were cultured at 37℃ and 32℃, and then immunostained with anti-p53 antibody (PAb421). 37℃ for cytoplasm, 32℃ for nucleus staining. The p53-binding DNA sequence is analyzed by Fragment A. Fragment A-protein complexes were detected in nuclear extracts of cultured cells at 32℃ and at 37℃. The wild-type p53 fragment was identified as a new gene. The development of wild-type p53 in leukemia cell lines is accompanied by a decrease in cell proliferation and induction. 1-2-3 cells were cultured at 37℃ and 32℃. At 32℃, the cell proliferation rate was low. DNA fragmentation was observed at 1.5% of the total DNA extracted from the cells. The expression of bcl-2, bax, fas, and cyclin G, which is related to cell cycle regulation, is activated. p53 gene mutation is related to cell cycle regulation and the possibility of gene function inhibition and cell proliferation maintenance is discussed. In addition, the possibility that wild-type p53 appears at elevated temperatures and that its cytoplasmic internalization is associated with heat-shock recognize protein 70(HSC70) is also examined. The possibility that cytosolic internalization is associated with cycloheximide treatment and heterotypic p53 binding to HSC70 is also examined.