巨大ヒトゲノム導入による機能解析

本研究は巨大DNAのマニピュレーションに画期的威力を発揮できるYACテクノロジーを応用して、(1)YAC導入による機能解析、(2)導入YACの動態の解析、(3)導入効率の改善と発現クローニング法への応用を行なって、新しい側面からバイオサイエンスをサポートすることを目的とする。本年度は導入実験の対象として、ヒトMDR1遺伝子領域を用いて、以下の点について検討を加え実績を上げた。1)YACを用いることにより、いわゆる挿入位置効果を回避できるか?:MDR1のcDNAを用いた導入実験(Ueda et al.1988)によると、薬剤耐性トランスフェクタント/Neo^rトランスフェクタントの効率は0.06%である。今回ヒトMDR1遺伝子を持つYAC導入株を単離し解析したところ、全てのクローンでヒトMDR1遺伝子が発現し、制ガン剤ビンクリスチンに耐性を獲得していた。すなわち、YACを用いることにより導入DNAの挿入位置効果を回避できる可能性が示唆された。2)YAC導入法をどのようにシス制御機構解析に応用できるか?:導入株のいずれにおいても、導入ヒトMDR1遺伝子の増幅及び発現促進が認められたのに対し、マウスの内在性mdr遺伝子の発現、増幅は見られなかった。この選択的発現機構につきいくつかの可能性を検討した結果、DNAメチル化による制御が示唆された。5aza-CdR処理によりマウスの内在性mdr遺伝子の発現が誘導され、この可能性が確認されるとともに、YAC導入によるシス制御機構の解析の有効性が示された。3)移入効率上昇の試み:PEGより融合効率の上昇が期待されるリポゾーム・センダイウイルスフュージョンをYAC導入に応用するために、YACのリポゾームへの封入を試みたが剪断力によるDNAの断片化が避けられなかった。線状巨大DNAは剪断力に弱いというYAC DNAの存在状態そのものを根本的に見直す必要があると考えられた。今後、移入の効率を上昇させるために、YACを環状化した後導入する方法を開発する。そのために、酵母菌内で環状化させるためのベクターを構築する。

本研究は巨大DNAのマニピュレーションに画期的威力を発揮できるYACテクノロジーを応用して、(1)YAC導入による機能解析、(2)導入YACの動態の解析、(3)導入効率の改善と発現クローニング法への応用を行なって、新しい側面からバイオサイエンスをサポートすることを目的とする。本年度は導入実験の対象として、ヒトMDR1遺伝子領域を用いて、以下の点について検討を加え実績を上げた。1)YACを用いることにより、いわゆる挿入位置効果を回避できるか?:MDR1のcDNAを用いた導入実験(Ueda et al.1988)によると、薬剤耐性トランスフェクタント/Neo^rトランスフェクタントの効率は0.06%である。今回ヒトMDR1遺伝子を持つYAC導入株を単離し解析したところ、全てのクローンでヒトMDR1遺伝子が発現し、制ガン剤ビンクリスチンに耐性を獲得していた。すなわち、YACを用いることにより導入DNAの挿入位置効果を回避できる可能性が示唆された。2)YAC導入法をどのようにシス制御機構解析に応用できるか?:導入株のいずれにおいても、導入ヒトMDR1遺伝子の増幅及び発現促進が認められたのに対し、マウスの内在性mdr遺伝子の発現、増幅は見られなかった。この選択的発現機構につきいくつかの可能性を検討した結果、DNAメチル化による制御が示唆された。5aza-CdR処理によりマウスの内在性mdr遺伝子の発現が誘導され、この可能性が確認されるとともに、YAC導入によるシス制御機構の解析の有効性が示された。3)移入効率上昇の試み:PEGより融合効率の上昇が期待されるリポゾーム・センダイウイルスフュージョンをYAC導入に応用するために、YACのリポゾームへの封入を試みたが剪断力によるDNAの断片化が避けられなかった。線状巨大DNAは剪断力に弱いというYAC DNAの存在状態そのものを根本的に見直す必要があると考えられた。今後、移入の効率を上昇させるために、YACを環状化した後導入する方法を開発する。そのために、酵母菌内で環状化させるためのベクターを構築する。