巨大ヒトゲノム導入による機能解析

引入巨型人类基因组进行功能分析

• 批准号: 08283218
• 负责人: 和田 守正
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08283218/
• 关键词: 酵母人工染色体; YAC; 機能的導入; 発現クローニング; メチル化; 遺伝子発現; ABCファミリー; MDR

本研究は巨大DNAのマニピュレーションに画期的威力を発揮できるYACテクノロジーを応用して、(1)YAC導入による機能解析、(2)導入YACの動態の解析、(3)導入効率の改善と発現クローニング法への応用を行なって、新しい側面からバイオサイエンスをサポートすることを目的とする。本年度は導入実験の対象として、ヒトMDR1遺伝子領域を用いて、以下の点について検討を加え実績を上げた。1)YACを用いることにより、いわゆる挿入位置効果を回避できるか?:MDR1のcDNAを用いた導入実験(Ueda et al.1988)によると、薬剤耐性トランスフェクタント/Neo^rトランスフェクタントの効率は0.06%である。今回ヒトMDR1遺伝子を持つYAC導入株を単離し解析したところ、全てのクローンでヒトMDR1遺伝子が発現し、制ガン剤ビンクリスチンに耐性を獲得していた。すなわち、YACを用いることにより導入DNAの挿入位置効果を回避できる可能性が示唆された。2)YAC導入法をどのようにシス制御機構解析に応用できるか?:導入株のいずれにおいても、導入ヒトMDR1遺伝子の増幅及び発現促進が認められたのに対し、マウスの内在性mdr遺伝子の発現、増幅は見られなかった。この選択的発現機構につきいくつかの可能性を検討した結果、DNAメチル化による制御が示唆された。5aza-CdR処理によりマウスの内在性mdr遺伝子の発現が誘導され、この可能性が確認されるとともに、YAC導入によるシス制御機構の解析の有効性が示された。3)移入効率上昇の試み:PEGより融合効率の上昇が期待されるリポゾーム・センダイウイルスフュージョンをYAC導入に応用するために、YACのリポゾームへの封入を試みたが剪断力によるDNAの断片化が避けられなかった。線状巨大DNAは剪断力に弱いというYAC DNAの存在状態そのものを根本的に見直す必要があると考えられた。今後、移入の効率を上昇させるために、YACを環状化した後導入する方法を開発する。そのために、酵母菌内で環状化させるためのベクターを構築する。

This study aims to explore the application of YAC technology in the development of the power of large DNA in the development stage,(1) the functional analysis of YAC introduction,(2) the dynamic analysis of YAC introduction,(3) the application of YAC technology in the improvement of introduction efficiency, and the development of new technology in the development stage. This year, we will introduce new technologies and technologies to improve our performance. 1)YAC MDR1 cDNA was successfully introduced into the genome (Ueda et al. 1988). The efficiency of MDR1 cDNA was 0.06%. Now, the MDR1 gene has been analyzed and the MDR1 gene has been developed and the resistance has been obtained. The possibility of avoiding the insertion site of DNA into the genome is demonstrated. 2)YAC import method: The increase and development of MDR1 gene in the introduced plants promote the development and development of MDR 1 gene. The detection mechanism of this selection is to investigate the possibility of detection, and to control the detection of DNA. The intrinsic mdr gene expression of 5aza-CdR treatment is induced, the possibility of this is confirmed, and the effective analysis of YAC control mechanism is demonstrated. 3)The increase in migration efficiency is expected to result in the increase in PEG fusion efficiency and the decrease in DNA fragmentation. Linear giant DNA shear force is weak, YAC DNA exists in the state of existence, and the root of the problem is necessary. In the future, the rate of migration will increase, and the method of introducing YAC will be developed. Cycling in yeast and yeast

项目成果

H.Kusaba: "Functional expression of yeast artificial chromosome (YAC)-human multidrug resistance genesin mouse cells." Genome Research. 5. 245-258 (1995)

H.Kusaba：“酵母人工染色体（YAC）-人类多药耐药基因在小鼠细胞中的功能表达。”

Taniguchi,K.: "A human canalicular multispecific or ganic anion transporter (cMOAT) gene is overexpressed in cisplatin resistant human cancer cell lines with decreased drug accumulation." Cancer Research. 56. 4124-4129 (1996)

Taniguchi,K.：“人小管多特异性或有机阴离子转运蛋白 (cMOAT) 基因在顺铂耐药的人癌细胞系中过度表达，药物蓄积减少。”

Taniguchi,K.: "Drug-incluced down-regulation of topoisomeraase I in human epider moid cancer cells resistant to saintopin and camptothecins." Cancer Research. 56. 2348-2354 (1996)

Taniguchi, K.：“在对圣托品和喜树碱耐药的人表皮样癌细胞中，药物导致拓扑异构酶 I 下调。”

Hisano,T.: "Increased Expression of T-Plastin Gene in Cisplatin-Resistant Human Cancer Cells : Identification by mRNA Differential Dysplay." FEBS Letter. 397. 101-107 (1996)

Hisano,T.：“顺铂抗性人类癌细胞中 T-Plastin 基因的表达增加：通过 mRNA 差异性失调进行鉴定”。

K.Torigoe: "YAC-based 1.5 Mb contig spanning the human multidrug resistantce gene region and delineating the amplification unit in two human multidrug resistant cell lines." Genome Research. 5. 233-244 (1995)

K.Torigoe：“基于 YAC 的 1.5 Mb 重叠群跨越人类多重耐药基因区域，并描绘了两种人类多重耐药细胞系中的扩增单元。”