权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

EBウイルス感染細胞内におけるウイルスゲノム複製及び保持機構の解析

EB病毒感染细胞中病毒基因组复制和保留机制分析

基本信息

批准号：
14021138
负责人：
鶴見達也
金额：
$ 3.84万
依托单位：
Aichi Cancer Center Research Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14021138/
关键词：
Epstein-Barr Virus DNA複製 DNAポリメラーゼウイルス感染症癌酵素ゲノム

项目摘要

本研究はEBVゲノム複製機構とそれをサポートする宿主機能の役割の解明のため以下の3つの観点((1)潜伏感染EBVゲノム複製機構(2)溶解感染EBVゲノム複製機構(3)潜伏感染からの再活性化の機構解明)から研究を推進することを目標とし、以下の成果を得た。1)潜伏感染EBVゲノム複製機構:細胞透過性化学架橋剤DSPによる解析法を確立し、それを用いてORC1/CDC6の核マトリックス結合をより確かに示した。また、ORC1はS期においてproteasomeにおいて分解されることを明らかにした。これも再複製の抑制に寄与していると考えられる。ORC2に関しては、核結合型の約半数がDNaseで可溶化されたものの、残りはORC1同様核マトリックスに結合していることがわかった(J. Biol. Chem.277:10354-10361 2002)。以一方、MCMはより広範囲のクロマチンに分布していた。2)溶解感染EBVゲノム複製機構:BALF5蛋白質はポリメラーゼcatalytic蛋白質であるが、自身のポリメラーゼprocessivityは低い。反応系にBMRF1蛋白質を添加するとBALF5蛋白質は非常に高いprocessivityを持つ酵素に変換する。ウイルス産生を誘導したB95-8細胞、および組み換えバキュロウイルス感染昆虫細胞の抽出液をショ糖密度勾配遠心法で解析したところ、両蛋白質は生理的条件下においてheterodimerを形成することが明らかとなった。この複合体形成は400mM NaCl存在下ではdisruptされる。また一部はheterodimer二つから成るdimericunitsを形成していることが示唆された。EBV複製フォークではこの複合体がcoordinateしながら両鎖合成を行なっていると考えられる〔投稿準備中〕。3)潜伏感染からの再活性化の機構解明:EBV潜伏感染細胞において、EBV Lytic cycleへの移行後ウイルスゲノム複製がどのような細胞周期環境下でおこり、また宿主DNA複製がどのように制御されるのかを知るために、我々は、細胞に余分な刺激を与えることなく、EBV lytic cycleを誘導できるtet-on細胞株を樹立し、lytic cycleと宿主細胞周期との相互関係を検討した。この細胞株はlytic cycleを誘導すると細胞増殖停止が観察された。Lytic cycleを誘導した細胞のほとんどがG1/early S期で停止していた。BrdUの取り込みを解析したところ、ウイルスDHA合成は2N DNA contentをもつ細胞で顕著に起こり、宿主DNA合成の抑制が観察された。lytic cycleへの移行前後で細胞周期停止に関与する因子であるp53,CDK inhibitorであるp21,p27の量的変動は無く、cyclinA, cyclinEといったS期進行に関与する蛋白質の発現増加が観察され、Rbのリン酸化型の蓄積が認められた。またlytic cycleにおいてRbをリン酸化しているのは主にCDK2であることが示された。EBV潜伏感染Bリンパ球における再活性化は、G1/S期境界を越えたS期CDK活性の高い状況下において起こることが示唆された(Kudoh et al. J. Virol.77:851-861.2003)。

This study aims to advance the research based on the following three points ((1) EBV host replication mechanism for latent infection (2) EBV host replication mechanism for lytic infection (3) mechanism for reactivation of latent infection) and the following results were achieved. 1)Latent infection EBV replication mechanism: cell-permeable chemical bridging agent DSP analysis method to establish, and use ORC1/CDC6 nuclear binding method to determine ORC1 is a proteasome. This is the first time I've ever seen a woman who's had sex with someone else. About half of ORC2-related and nucleus-bound DNases are solubilized and residues of ORC1-related and nucleus-bound DNases are solubilized (J. Biol. Chem.277:10354-10361 2002). In a square, MCM is distributed according to the size of the square. 2)Lysis of EBV replication mechanism:BALF5 protein is not a catalytic protein, its own is not a processivity. BMRF1 protein is added to the system, and BALF5 protein is very high in processivity and enzyme activity. It is induced in B95 -8 cells, and the protein is formed under physiological conditions. The complex formation was disrupted in the presence of 400mM NaCl. A part of the heterodimer is formed into dimericunits. EBV replication complex coordinates and locks synthesis. 3)The mechanism of latent infection and reactivation is explained:EBV latently infected cells are infected with EBV Lytic cycle, and the host DNA replication is controlled under the cell cycle environment. The cell line was observed to have a lytic cycle. Lytic cycle induced cell arrest in G1/early S phase BrdU DNA synthesis and 2N DNA content are detected in cells, and inhibition of host DNA synthesis is detected. Changes in the amounts of p53,CDK inhibitor, p21,p27 related to cell cycle arrest before and after lytic cycle progression were observed, and increases in protein production were observed during cyclin A, cyclin E, and accumulation of Rb in the acidified form. A lytic cycle, Rb, and CDK2. EBV latent infection B gene reactivation, G1/S phase transition, S phase CDK activity and high level of the state of the beginning of the transition (Kudoh et al. J. Virol.77:851-861.2003).